26
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian tentang kinetika penetrasi PPD dalam pewarna rambut oksidatif pada kulit manusia termasuk jenis penelitian eksperimental murni
dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah massa
sampel yang diaplikasikan pada kulit dan waktu pengambilan PBS dalam kompartemen akseptor FDC.
b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah
lag time , koefisien permeabilitas, dan DA
event
PPD pewarna rambut oksidatif pada kulit.
c. Variabel pengacau terkendali. Kemurnian pelarut yang digunakan,
dapat diatasi dengan mengunakan pelarut pro analysis p.a.. d.
Variabel pengacau tak terkendali. Susunan dan ketebalan kulit yang tidak bisa dikendalikan karena tergantung pada subyek penelitian yang tersedia.
2. Definisi operasional
a. Sampel pewarna rambut oksidatif adalah sampel pewarna rambut yang
mengandung PPD dan kadarnya tidak diketahui. b.
Waktu pengambilan cairan PBS dalam kompartemen akseptor FDC adalah waktu yang dimulai sejak sampel pewarna rambut oksidatif diaplikasikan
ke kulit pada rangkaian FDC hingga cairan PBS dalam kompartemen akseptor FDC diambil sampling.
c. Lag time adalah waktu yang dibutuhkan bagi PPD untuk mencapai steady
state yang didapatkan dari ekstrapolasi hubungan antara massa senyawa
yang terpenetrasi dengan waktu. d.
Koefisien permeabilitas adalah nilai yang melambangkan laju penetrasi PPD melalui kulit.
e. Dose absorbed per event DA
event
adalah dosis PPD yang terasborbsi untuk setiap kali pemakaian suatu produk.
f. Aparatus FDC yang digunakan adalah seperangkat alat FDC unjacketed
tipe lipatan dasar datar ground o-ring, dengan diameter lubang 11 mm dan volume reseptor 2,76 mL.
g. Sistem HPLC yang dipakai adalah sistem HPLC fase terbalik dengan
kolom fase diam C-18 dan fase gerak campuran akuades, NH
4
OH 10, dan asetonitril dengan perbandingan dan flow rate optimum. Detektor
yang digunakan adalah detektor UV dengan panang gelombang 254 nm.
C. Bahan Penelitian
Bahan yang
digunakan dalam
penelitian adalah
baku paraphenylenediamine
PPD Sigma Aldrich, metanol, asetonitril, amonium hidroksida, natrium metabisulfit, natrium klorida, kalium klorida, dinatrium
hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat kualitas p.a. E. Merck, akuades dan akuabides Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi USD,
sampel pewarna rambut oksidatif, larutan ringer laktat PT Widatra Bhakti, dan kulit khatan praeputium manusia berumur di bawah 18 tahun yang diperoleh
dari Juru Supit Bogem, Kalasan, Yogyakarta.
D. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik OHAUS pioneer tm PA214, Franz Diffusion Cell FDC, water purifier Thermo Scientific
Easy pure II Barnstead, kertas Whatman dengan ukuran pori 0,45 µm, syringe,
mikropipet, milipore filter, hot plate IKA® RH Basic KTC, alat ultrasonifikasi Branson 3510, seperangkat peralatan preparasi kulit khatan praeputium, dan
seperangkat alat-alat gelas Pyrex. High Performance Liquid Chromatography HPLC yang digunakan adalah HPLC sistem fase terbalik dengan detektor
ultraviolet Waters Associate model 441, injektor Rheodyne 7125 loop 20 µL, oven Waters Millipore® 1122, CBM-102 Shimadzu, pompa Waters model 510,
kolom C18 Shinwa Chemical Industries, LTD, dimensi 150 x 4.0 mm 5 µm STR ODS-II, seperangkat komputer dengan aplikasi LabSolutions Shimadzu,
GCSolution version 2.30.00SU4.
E. Tata Cara Penelitian
Studi absorpsi perkutan PPD ini mengadopsi Organization for Economic Co-operation Development
OECD Guideline for the Testing of Chemicals Skin Absorption: in vitro Method
tahun 2004 yang disertai beberapa perubahan dari penulis.
1. Pembuatan fase gerak untuk sistem HPLC
Fase gerak yang digunakan adalah campuran akuades, NH
4
OH 10, dan asetonitril sesuai dengan hasil optimasi Emelia 2015, yaitu akuades + NH
4
OH 10 : asetonitril 90:10.
2. Pembuatan PBS pH 7,4 konsentrasi 0,01 M
Sebanyak 800 mL akuabides dimasukkan dalam gelas beker 1 L, ditambah 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na
2
HPO
4
, dan 0,24 g KH
2
PO
4
diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larut sempurna. Derajat keasaman larutan
diukur dengan pH meter dan pH larutan dibuat 7,4 dengan penambahan HCl. Larutan dipindahkan dalam labu takar 1 L, ditambah akuabides sampai tanda.
3. Pembuatan kurva baku PPD
a. Pembuatan larutan natrium metabisulfit 0,001 M. Sejumlah 190,107
mg natrium metabisulfit ditimbang seksama lalu dilarutkan dalam akuades yang telah disaring dengan kertas Whatman hingga 1 L.
b. Pembuatan larutan stok PPD 2 mgmL. Sejumlah 100,0 mg baku PPD
ditimbang seksama lalu dilarutkan dengan larutan natrium metabisulfit dan diencerkan hingga batas dalam labu takar 50 mL.
c. Pembuatan larutan intermediet PPD 40 gmL. Sejumlah
20 L
larutan stok PPD 2 mgmL diambil dan ditambahkan dengan 980 L larutan
natrium metabisulfit sehingga didapatkan larutan intermediet PPD 40 gmL.
d. Pembuatan seri larutan baku PPD 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 gmL. Sejumlah
5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 L larutan intermediet baku PPD 40 gmL diambil lalu
masing-masing ditambahkan dengan sebanyak 195, 190, 185, 180, 170, 160, 150 L larutan natrium metabisulfit sehingga didapatkan seri larutan baku PPD 1, 2, 3,
4, 6, 8, 10 gmL. Seri larutan baku diinjekkan ke sistem HPLC.
4. Uji difusi dengan FDC
a. Penyiapan sampel. Sampel pewarna rambut oksidatif yang digunakan
adalah campuran dari 20 bungkus sampel pewarna rambut oksidatif yang didapatkan dari enam tempat penjualan sampel berbeda. Sampel ditimbang satu
per satu untuk pengujian keseragaman bobot, lalu dihomogenkan dengan mortir dan stamper.
b. Preparasi kulit khatan praeputium. Segera setelah kulit khatan
diambil dari subyek penelitian, kulit khatan dipindahkan ke cairan ringer laktat. Sebelum penyimpanan pada suhu -4
o
C, kulit dibersihkan dari jaringan subkutan. Apabila sudah siap digunakan, kulit dipotong sesuai dengan ukuran FDC dan
dipasang pada FDC dengan bagian stratum korneum menghadap ke bagian atas,
lalu kompartemen akseptor dimasukkan magnetic stirrer dan diisi PBS hingga penuh. Suhu FDC dijaga 31 - 33
o
C. Perangkat FDC dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8. Skema FDC
c. Penetapan profil kinetika penetrasi PPD. Sampel diambil sebanyak
300 mg, lalu dicampurkan dengan 750 µL akuades. Sampel yang berbentuk pasta diambil dan ditimbang sekitar 1
–5 mg, lalu diaplikasikan pada kulit khatan. Cairan PBS dari kompartemen reseptor diambil pada jam ke-0,5; 1; 1,5; 2; 2,5;
3,5; 4,5; 5,5; 6,5; 7,5; 8,5; 9,5; 10,5; 11,5, lalu diganti dengan volume cairan PBS yang sama. Cairan dalam kompartemen akseptor FDC diinjek ke dalam sistem
HPLC. Langkah ini diulangi sebanyak lima kali sehingga terdapat lima variasi massa sampel pewarna rambut oksidatif yang diaplikasikan. Pasta yang tersisa
dianalisis sesuai dengan langkah analisis sampel pada penelitian Feliana 2015 untuk mengetahui massa PPD dalam pasta, yang selanjutnya digunakan untuk
menghitung massa PPD dalam kompartemen donor.
Kompartemen donor FDC
Kulit
Kompartemen akseptor FDC Magnetic stirrer
F. Analisis Hasil
1. Kurva baku PPD. Analisis hasil dilakukan dengan memplotkan
hubungan antara konsentrasi PPD dengan data AUC hasil injeksi yang didapat pada tiap konsentrasi. Persamaan regresi linier y = bx + a yang didapat merupakan
standar eksternal yang dapat digunakan dalam penentuan konsentrasi PPD pada penetapan kadar PPD dalam uji difusi dengan FDC.
2. Profil kinetika penetrasi PPD. Konsentrasi PPD tiap waktu sampling
ditetapkan berdasarkan AUC yang didapat. Konsentrasi PPD dapat dikonversi ke massa PPD dengan mengalikan konsentrasi PPD dengan volume sampel yang
diinjek. Grafik hubungan antara massa PPD dan waktu pada steady state ditentukan sehingga persamaan regresi linear y = bx + a dapat diketahui. Lag
time adalah nilai waktu yang memotong sumbu x, yaitu pada saat y = 0.
a b
τ = lag time jam
a = intersep
b = slope
Kadar PPD dalam sampel dapat diketahui berdasarkan standar eksternal. Massa PPD dalam kompartemen donor dapat diketahui dengan rumus:
M
donor
= Ms x C M
donor
= massa PPD dalam kompartemen donor µg Ms = massa sampel yang dioleskan mg
C = kadar PPD dalam sampel µgmg
Massa PPD dalam kompartemen donor dapat digunakan untuk
menentukan C
donor
dengan rumus:
C
donor
= konsentrasi PPD pada kompartemen donor µgmL M
donor
= massa PPD dalam kompartemen donor µg V
= volume FDC mL Koefisien permeabilitas PPD pada kulit manusia dapat ditentukan
melalui rumus:
K
p
o e A
C
dono
C
a e to
K
p
= koefisien permeabilitas cmjam slope
= nilai slope grafik hubungan antara C
receiver
dengan waktu V
= volume FDC mL A
= luas area kulit cm
2
C
donor
= konsentrasi PPD pada kompartemen donor µgcm
3
C
acceptor
= konsentrasi PPD pada kompartemen akseptor µgcm
3
Berdasarkan nilai t
event
dan t, DA
event
dapat dihitung dengan rumus yang berbeda. Apabila nilai t
event
lebih kecil daripada t, maka DA
event
dapat dihitung dengan rumus:
DA
e ent
2 K
p
C t
e ent
DA
event
= dose absorbed per event µgcm
2
K
p
= koefisien permeabilitas cmjam C
v
= konsentrasi PPD pada kompartemen donor µgcm
3
τ = lag time jam
t
event
= durasi aplikasi sampel jam Apabila nilai t
event
lebih besar daripada t, maka DA
event
dapat dihitung dengan rumus:
DA
e ent
K
p
C t
e ent
1 B 2
1 3 B 1 B
DA
event
= dose absorbed per event µgcm
2
K
p
= koefisien permeabilitas cmjam C
v
= konsentrasi PPD pada kompartemen donor µgcm
3
t
event
= durasi aplikasi sampel jam B
= K
ow
10
4
τ = lag time jam
Nilai t dapat ditentukan berdasarkan nilai B. Apabila B lebih kecil atau
sama dengan 0,1, maka t dapat dihitung dengan rumus: t
2, t
= waktu bagi PPD untuk mencapai steady state pada kondisi uji jam τ
= lag time jam Apabila B lebih besar dari 0,1 dan lebih kecil atau sama dengan 1,17,
maka t dapat dihitung dengan rumus: t
, log B t
= waktu bagi PPD untuk mencapai steady state pada kondisi uji jam B
= K
ow
10
4
τ = lag time jam
Apabila B lebih besar dari 1,17, maka t dapat dihitung dengan rumus:
t b b
2
c
2
t = waktu bagi PPD untuk mencapai steady state pada kondisi uji jam
τ = lag time jam
b 2 1 B
2
– c c
= 1 + 3 x B3
35
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Pewarna rambut meupakan salah satu kosmetik yang umum digunakan. Paraphenylenediamine
PPD adalah salah satu senyawa yang biasanya ditambahkan dalam pewarna rambut untuk memberikan warna yang lebih tahan
lama pada rambut. Produk pewarna rambut yang mengandung PPD dibiarkan pada kulit kepala untuk beberapa saat, memberikan waktu bagi PPD berkontak
dengan rambut. Kontak ini mengenai bagian kulit kepala pula yang dapat memicu difusi PPD ke kulit dan menembus hingga sirkulasi darah yang terdapat di dermis.
Telah diketahui sebelumnya pula bahwa masuknya PPD dalam sirkulasi darah melalui kulit dapat menimbulkan reaksi hipersensitivitas tipe lambat yang
bermanifestasi sebagai dermatitis kontak alergi. Oleh karena itu, penting untuk menentukan profil kinetika penetrasi sehingga dapat diketahui seberapa besar
dosis PPD yang dapat terabsorpsi oleh sirkulasi darah untuk setiap penggunaan produk pewarna rambut oksidatif yang digunakan dalam penelitian ini. Dosis
tersebut dapat dibandingkan dengan hasil dosis absorpsi pada penelitian lalu yang menggunakan kulit orang Kaukasia untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan
penetrasi PPD antara kulit orang Asia dan Kaukasia. Franz Diffusion Cell
FDC adalah sistem yang dapat digunakan untuk mendapatkan profil kinetika penetrasi PPD pewarna rambut oksidatif melalui
kulit. Kulit yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit khatan. Alat yang dapat digunakan untuk menetapkan kadar PPD adalah HPLC yang dilengkapi
Kategori