Validasi metode analisis Para-Phenylenediamine (PPD) dalam formulasi pewarna rambut oksidatif.

INTISARI

Para-phenylenediamine (PPD) merupakan salah satu komponen dalam pewarna rambut oksidatif. Menurut Dirjen POM RI (2008), batas konsentrasi kandungan PPD dalam sediaan pewarna rambut yang diperbolehkan yaitu 6%. Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode analisis PPD dalam formulasi pewarna rambut oksidatif.

Analisis PPD dalam pewarna rambut menggunakan metode KCKT yang disertai dengan ekstraksi padat-cair dan clean-up dengan SPE C18. Ekstraksi dilakukan dengan pelarut sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Pada SPE volume loading sampel yang digunakan yaitu 100 µL. Sistem KCKT yang digunakan yaitu fase terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak ACM : aquades/ ammonium hidroksida 10% (10:90), laju alir 0,5 mL/ menit dan detektor UV dengan λ 254 nm.

Parameter validasi yang ditentukan yaitu spesifisitas, linearitas, akurasi, presisi, dan sensitivitas. Hasil menunjukkan bahwa metode analisis PPD: spesifik dengan nilai Rs ≥ 1,5; linear dengan koefisien korelasi (r) pada replikasi 1, 2 dan 3 berturut-turut sebesar 0,9915, 0,9942 dan 0,9932; tidak akurat dengan nilai %perolehan kembali sebesar 104,3 – 180,0% (CV= 14,5 – 85,6%); tidak presisi dinyatakan dengan f hitung 5,54 > f tabel sebesar 3,68, nilai DL yang diperoleh sebesar 686 – 942 ng/mL; nilai QL yang diperoleh sebesar 2288 – 3138 ng/mL. Kadar PPD dalam pewarna rambut oksidatif yaitu 2,92 – 4,57% b/b.

Kata kunci : para-phenylenediamine, pewarna rambut oksidatif, clean-up,

ABSTRACT

Para-phenylenediamine (PPD) is a compound found in oxidative hair dyes formulation. According to Dirjen POM RI (2008), maximum concentration of PPD in hair dyes is 6%. The purpose of this study is to validate the PPD analysis method in oxidative hairdye formulation.

Analysis PPD in hairdye is conducted using HPLC method followed by solid-liquid extraction and clean-up using SPE C18. Solvent for extraction is Sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. For SPE method, volume for sample loading is 100 µL. Reversed-phase HPLC system in this study uses C18 column, mobile phase composition of ACM : aquadest/ ammonium hidroxide 10% (10:90), flow rate 0,5 mL/minute and UV detector at wavelength 254 nm.

Validation parameters examined are specificity, linearity, accuracy, precision, and sensitivity. The results show validity: specific with Rs ≥ 1,5; linear with r for replication 1, 2 and 3 in consecutive order are 0,9915, 0,9942 and 0,9932; not accurate with % recovery is 104,3 – 180,0%, not precise with f calculated 5,54 > f table 3,68, DL is 686 – 942 ng/mL,and QL is 2288 – 3138 ng/mL. Concentration of PPD in oxidative hair dye formulation is 2,92 – 4,57% b/b.

Keyword : para-phenylenediamine, oxidative hair dyes, clean-up, solid phase extraction, HPLC, method validation.

VALIDASI METODE ANALISIS PARA-PHENYLENEDIAMINE (PPD) DALAM FORMULASI PEWARNA RAMBUT OKSIDATIF

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh: Cynthia Feliana NIM : 118114104

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“

The will to win, the desire to succeed, the urge to

reach your full potential... these are the keys that will

unlock

the door to personal excellence.”

- Confucius -

“

Live as if you were to die tomorrow. Learn as if you

were to live forever.

”

-

Mahatma gandhi –

Karya ini kudedikasikan untuk orang tua, keluarga,

sahabat, kekasih, dan almamaterku tercinta.

vii

Puji dan syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas cinta dan berkatnya yang luar biasa, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul “Validasi Metode Analisis Para-Phenylenediamine (PPD) Dalam Formulasi Pewarna Rambut Oksidatif” sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Penulisan skripsi ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak dengan adanya motivasi, kritik, saran, diskusi, dan bimbingan. Oleh karena itu penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada:

1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku dosen pembimbing dan penguji yang telah meluangkan waktunya untuk memberikan bimbingan, motivasi, kritik, dan saran selama penelitian dan penulisan skripsi ini.

2. Jeffry Julianus, M.Si. dan F. Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku dosen penguji yang memberikan kritik dan saran untuk membangun skripsi ini. 3. Aris Widayati, M.Si., Ph. D., Apt. selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma atas teladan yang diberikan.

4. Pak Sanjaya yang telah banyak meluangkan waktunya untuk mendampingi, memotivasi, membantu, dan menjadi teman bagi penulis selama penelitian dan penulisan skripsi ini.

5. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas ilmu, pengalaman, dan persahabatan yang dibagikan.

6. Papa, mama, koko dan seluruh anggota keluargaku yang tercinta yang selalu memberikan semangat dan doa untuk keberhasilanku.

viii

7. Kekasih sekaligus sahabat yang selalu memberikan semangat dan doa selama penelitian dan penulisan skripsi ini.

8. Sahabat-sahabatku tercinta Centel, Nyahti, Pika, Anka, Dea, dan Gabby atas persahabatan, doa, dan semangatnya selama ini.

9. Aphui, Bayi, dan Cancan selaku sahabat dalam perjuangan penelitian dan penulisan skripsi ini.

10. Cingap, Elyn, Evi, Ester, Siska, Empit, Kingkong, Berle, Ahen, dan Loren Cik Lulu, Cik Anis, Cik Steph, Cik Maria, dan Valen selaku teman-teman baikku selama di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas persahabatan dan semangat yang telah diberikan.

11. Seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu atas segala bantuan , semangat, dan doa sehingga penulis bisa sampai pada tahap ini.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan skripsi ini atas segala keterbatasan yang dimiliki penulis. Untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang dapat membangun dari semua pihak. Akhir kata, penulis mempersembahkan skripsi ini demi kemajuan ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, 5 Juni 2015

ix

Halaman

HALAMAN JUDUL ……….. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ………. ii

HALAMAN PENGESAHAN ……… iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ……...……….. iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...……….. v

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...……….. vi

PRAKATA ……….. vii

DAFTAR ISI ………... ix

DAFTAR TABEL ………... xii

DAFTAR GAMBAR ……….. xiii

DAFTAR LAMPIRAN ………... xiv

INTISARI ……… xvii

ABSTRACT ……….. xviii

BAB I PENGANTAR ………... 1

A.Latar Belakang ……….... 1

1. Permasalahan ………... 3

2. Keaslian Penelitian ………... 3

3. Manfaat Penelitian ……… 4

B.Tujuan Penelitian ……….... 4

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ………. 5

A.Pewarna Rambut ………. 5

1. Para-phenylenediamine(PPD) ………... 6

x

3. Sodium Perborat Tetrahidrat ………... 8

4. Asam Sitrat ……….. 8

5. Ekstrak Acacia concina ………... 9

6. Ekstrak Emblica officinalis ………. 9

B.Solid Phase Extraction(SPE) ………... 10

C.Kromatografi ………... 11

D.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ……….... 12

E. Validasi Metode Analisis ………. 14

F. Landasan Teori ……… 16

G.Hipotesis ………. 17

BAB III METODE PENELITIAN ………. 18

A.Jenis dan Rancangan Penelitian ………... 18

B.Variabel Penelitian ………... 18

1. Variabel bebas ……….. 18

2. Variabel tergantung ……… 18

3. Variabel pengacau Terkendali ……… 18

C.Definisi Operasional ……… 18

D.Bahan Penelitian ……….. 19

E. Alat Penelitian ……….. 20

F. Tata Cara Penelitian ……… 20

1. Penyiapan sampel pewarna rambut oksidatif ……… 20

2. Pembuatan larutan sodium metabisulfit 0,01 M ……….. 20

3. Pembuatan larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8 ………….. 21

4. Pembuatan fase gerak untuk KCKT ………...…… 21

xi

rambut dan perbandingan ekstrak sampel pewarna rambut

sebelum dan sesudah clean-up dengan KCKT ……… 22

7. Optimasi clean-up dengan SPE C18 ………..……… 23

8. Validasi metode clean-up PPD dengan SPE C18 ……….. 23

9. Validasi metode penetapan kadar PPD dengan metode standar adisi ... 24

10. Penetapan kadar para-phenylenediamine (PPD) dalam pewarna rambut dengan metode standar adisi ………. 25

G.Analisis Hasil ………. 26

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ………. 30

A. Penyiapan sampel pewarna rambut oksidatif ……….. 30

B. Validasi metode pengukuran PPD dengan KCKT ……….. 31

C. Identifikasi para-phenylenediamine dalam pewarna rambut oksidatif ……… 34

D. Perbandingan antara ekstrak sampel pewarna rambut sebelum dan sesudah clean-updengan SPE C18 ………. 36

E. Optimasi clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18 ………… 37

F. Validasi metode clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18 ……… 42

G. Validasi metode penetapan kadar PPD dengan metode standar adisi ………...… 44

H. Pengaruh matriks pewarna rambut dalam penetapan kadar para-phenylenediamine(PPD) ……….…. 47

xii

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ……….. 49

A.Kesimpulan ………... 49

B.Saran ……….. 49

DAFTAR PUSTAKA ………... 50

LAMPIRAN ……… 52

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I. Nilai r dan n kurva baku eksternal……..………. 33 Tabel II. Nilai r dan n kurva baku adisi metode clean-up dengan

SPE C18……….. 43 Tabel III. Rata-rata % perolehan kembali dan nilai CV perolehan

kembali metode SPE C18……….. 44

Tabel IV. Nilai r dan n kurva baku adisi metode

standar adisi ………..……….…… 45

Tabel V. Nilai % perolehan kembali dan nilai CV perolehan kembali metode penetapan kadar dengan metode standar

adisi ……….………... 46

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Struktur p-Phenylenediamine………...….. 6 Gambar 2. Struktur molekul sodium perborat …………..………….... 8 Gambar 3. Struktur molekul asam sitrat …...………. 8 Gambar 4. Proses Skematik Prosedur SPE ……….. 10 Gambar 5. Instrumen standar dalam KCKT ………... 13 Gambar 6. Kurva hubungan seri massa baku PPD dan respon

instrumen (AUC) ……….. 32

Gambar 7. (A) Kromatogram larutan sodium metabisulfit,

(B) Kromatogram baku PPD 8 µg/mL, (C) Kromatogram

sampel pewarna rambut oksidatif setelah clean-up………. 35 Gambar 8. (A) Kromatogram ekstrak sampel sebelum dilakukan

clean-up dengan SPE C18, (B) Kromatogram sampel

sesudah dilakukan clean-up dengan SPE C18……… 37 Gambar 9. Skema untuk pemilihan jenis SPE ……… 39 Gambar 10. (A) Kromatogram dengan volume loading sampel 100µL,

(B) Kromatogram dengan volume loading sampel 1 mL,

(C) Kromatogram baku PPD ………... 41 Gambar 11. Kurva hubungan antara seri massa adisi PPD dan respon

instrumen metode clean-up dengan SPE ………. 43 Gambar 12. Kurva hubungan antara massa baku adisi PPD dan respon

instrumen metode standar adisi replikasi

xv

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Sertifikat analisis baku para-phenylenediamine……….. 53 Lampiran 2. Data penimbangan untuk perhitungan keseragaman

bobot sampel pewarna rambut oksidatif ……...………… 54 Lampiran 3. Tabel hubungan n dan r

(Pearson’s correlation coefficient test) ……….. 55 Lampiran 4. Perhitungan Resolusi (Rs) ……….. 55 Lampiran 5. Persamaan regresi linear kurva baku eksternal

replikasi 1, 2, 3, dan kumulatif ……… 56 Lampiran 6. Kurva baku adisi metode clean-up dengan SPE C18 .… 56 Lampiran 7. Perolehan kembali metode clean-up dengan SPE C18…. 57 Lampiran 8. Kurva baku metode standar adisi ………... 57 Lampiran 9. Perhitungan uji signifikansi slope kurva baku adisi

3 replikasi dengan ANOVA satu arah ……… 58 Lampiran 10. Perolehan kembali dengan metode standar adisi ……….. 58 Lampiran 11. Penetapan kadar PPD dalam sampel pewarna rambut

oksidatif dengan metode standar adisi ……… 59 Lampiran 12. Uji signifikansi (uji t) antara slope kurva baku eksternal

xvii INTISARI

Para-phenylenediamine (PPD) merupakan salah satu komponen dalam pewarna rambut oksidatif. Menurut Dirjen POM RI (2008), batas konsentrasi kandungan PPD dalam sediaan pewarna rambut yang diperbolehkan yaitu 6%. Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode analisis PPD dalam formulasi pewarna rambut oksidatif.

Analisis PPD dalam pewarna rambut menggunakan metode KCKT yang disertai dengan ekstraksi padat-cair dan clean-up dengan SPE C18. Ekstraksi dilakukan dengan pelarut sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Pada SPE volume

loading sampel yang digunakan yaitu 100 µL. Sistem KCKT yang digunakan yaitu fase terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak ACN : aquades/ ammonium hidroksida 10% (10:90), laju alir 0,5 mL/ menit dan detektor UV

dengan 254 nm.

Parameter validasi yang ditentukan yaitu spesifisitas, linearitas, akurasi, presisi, dan sensitivitas. Hasil menunjukkan bahwa metode analisis PPD: spesifik

dengan nilai Rs ≥ 1,5; linear dengan koefisien korelasi (r) pada replikasi 1, 2 dan 3 berturut-turut sebesar 0,9915, 0,9942 dan 0,9932; tidak akurat dengan nilai %perolehan kembali sebesar 104,3 – 180,0% (CV= 14,5 – 85,6%); tidak presisi dinyatakan dengan f hitung 5,54 > f tabel sebesar 3,68, nilai DL yang diperoleh sebesar 686 – 942 ng/mL; nilai QL yang diperoleh sebesar 2288 – 3138 ng/mL. Kadar PPD dalam pewarna rambut oksidatif yaitu 2,92 – 4,58% b/b.

Kata kunci : para-phenylenediamine, pewarna rambut oksidatif, clean-up, solid phase extraction, KCKT, validasi metode.

xviii ABSTRACT

Para-phenylenediamine (PPD) is a compound found in oxidative hair dyes formulation. According to Dirjen POM RI (2008), maximum concentration of PPD in hair dyes is 6%. The purpose of this study is to validate the PPD analysis method in oxidative hairdye formulation.

Analysis PPD in hairdye is conducted using HPLC method followed by solid-liquid extraction and clean-up using SPE C18. Solvent for extraction is Sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. For SPE method, volume for sample loading is 100 µL. Reversed-phase HPLC system in this study uses C18 column, mobile phase composition of ACN : aquadest/ ammonium hidroxide 10% (10:90), flow rate 0,5 mL/minute and UV detector at wavelength 254 nm.

Validation parameters examined are specificity, linearity, accuracy, precision, and sensitivity. The results show validity: specific with Rs ≥ 1,5; linear with r for replication 1, 2 and 3 in consecutive order are 0,9915, 0,9942 and 0,9932; not accurate with % recovery is 104,3 – 180,0%, not precise with f calculated 5,54 > f table 3,68, DL is 686 – 942 ng/mL,and QL is 2288 – 3138 ng/mL. Concentration of PPD in oxidative hair dye formulation is 2,92 – 4,58% b/b.

Key words: para-phenylenediamine, oxidative hair dyes, clean-up, solid phase extraction, HPLC, method validation.

1 BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang

Pewarna rambut adalah sediaan kosmetik yang digunakan dalam tata rias rambut untuk mewarnai rambut atau untuk mengembalikan warna rambut asalnya (Dirjen POM, 1985). Pewarna rambut diklasifikasikan menjadi tiga jenis, yaitu pewarna rambut temporer, pewarna rambut semi-permanen, pewarna rambut permanen (Azis dan Muktiningsih, 1999). Dalam pewarna rambut permanen penyusun utamanya adalah para-phenyelenediamine atau para-aminophenol.

Para- phenyelenediamine (PPD) ini mempercepat proses pewarnaan rambut dan mungkin dapat menyebabkan efek toksik lokal maupun sistemik saat diaplikasikan secara topikal atau tertelan (Sutrapu, Jagadeeshwar, Nagulu, dan Vidyasagar, 2010).

Penggunaan PPD dosis tinggi dalam jangka pendek (efek akut) dapat menimbulkan dermatitis, mata iritasi dan berair, asma, gastritis, gagal ginjal, vertigo, tremor, kejang, dan koma pada manusia. Dermatitis kontak eczematous

mungkin terjadi dalam penggunaan jangka panjang (efek kronis) pada manusia. Menurut Scientific Committee on Consumer Products (SCCP), PPD merupakan agen sensitisasi kulit yang sangat kuat. Para-phenylenediamine (PPD) merupakan suatu alergen; bahkan apabila seseorang tidak menimbulkan reaksi saat penggunaan pertama, mereka dapat menjadi tersensitisasi oleh PPD dan dapat terjadi reaksi buruk saat penggunaan berulang (Al-Suwaidi dan Ahmed, 2010).

Menurut Dirjen POM RI (2008), batas konsentrasi kandungan PPD dalam sediaan yang diperbolehkan yaitu 6%. Pada kenyataannya, konsentrasi

kandungan PPD pada pewarna rambut jarang dicantumkan. Pada penelitian ini, penulis ingin melakukan validasi metode analisis PPD dalam pewarna rambut oksidatif. Penelitian ini akan melalui serangkaian proses yang mencakup identifikasi PPD dalam pewarna rambut dengan KCKT, perbandingan sebelum dan sesudah clean-up dengan SPE C18, optimasi clean-up PPD dengan SPE C18, validasi metode clean-up SPE C18, validasi metode penetapan kadar PPD dengan metode standar adisi dan penetapan kadar PPD dalam pewarna rambut oksidatif.

Untuk menjamin bahwa metode yang digunakan dalam penelitian berkualitas dan dapat dipercaya, maka perlu dilakukan validasi. Proses validasi yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi parameter spesifisitas linearitas, sensitivitas, akurasi, dan presisi.

Isolasi PPD dari matriks sampelnya menggunakan ekstraksi solven air karena PPD mudah larut dalam air (log Kow = -0,25). Setelah dilakukan ekstraksi, perlu dilakukan clean-up untuk mendapatkan analit yang terpisah dari matriks sampel. Metode clean-up yang yang digunakan adalah metode Solid Phase Extraction (SPE) dengan fase diam C18. Metode SPE C18 dipilih karena C18 bersifat non-polar sehingga diharapkan mampu menahan ko-ekstraktan pada sampel.

Hasil yang optimal dalam clean-up dapat dicapai dengan melakukan optimasi terlebih dahulu. Optimasi yang dilakukan yaitu dengan memvariasi volume loading sampel. Metode clean-up dengan SPE dikatakan berhasil jika puncak senyawa pengotor berkurang dan tidak mengganggu puncak analit. Hasil

clean-up diinjeksikan pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) yang metodenya telah dioptimasi dan divalidasi oleh Emelia (2015).

1. Permasalahan

a. Apakah matriks formulasi pewarna rambut oksidatif terdiri dari campuran yang kompleks sehingga perlu dilakukan clean-up dengan metode pemisahan yang sesuai?

b. Apakah ko-ekstraktan dapat tertahan pada sistem SPE C18-air sehingga kurva adisi pada hasil clean-up tidak berbeda signifikan dari kurva baku eksternal?

c. Apakah metode analisis PPD dalam pewarna rambut oksidatif dengan ekstraksi larutan sodium metabisulfit pH 8 dan clean-up C18-air dapat memenuhi kriteria validitas?

2. Keaslian penelitian

Sejauh penelusuran literatur, penelitian mengenai para-phenylenediamine

pernah dilakukan. Vincent, Bordin, dan Rodriguez (2002) melakukan penelitian mengenai validasi metode analisis PPD dalam pewarna rambut dengan menggunakan sistem KCKT dengan kolom C8, fase gerak asam asetat yang ditambah 10% amonia hingga pH 5,9 dan clean-up sampel menggunakan liquid-liquid extraction (LLE) dengan pelarut heksan. Al-Suwaidi dan Ahmed (2010) melalukan penelitian mengenai identifikasi dan kuantifikasi para-phenylenediamine dalam tato temporer. Dengan demikian, penelitian mengenai validasi metode analisis PPD dengan sistem KCKT menggunakan kolom C18,

fase gerak ACN: aquadest (10:90), dan clean-up menggunakan SPE C18 belum pernah dilakukan dalam suatu sediaan pewarna rambut.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai metode analisis PPD dengan clean-up menggunakan SPE C18 beserta parameter validasinya.

b. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi terkait optimasi clean-up dengan SPE C18 dan memberikan informasi bahwa metode clean-up dengan SPE C18 dapat digunakan untuk menetapkan kadar PPD dalam pewarna rambut dengan parameter validitasnya.

B. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui apakah matriks pewarna rambut oksidatif terdiri dari campuran yang kompleks sehingga perlu dilakukan clean-up dengan metode pemisahan yang sesuai.

2. Mengetahui apakah ko-ekstraktan tertahan pada sistem SPE C18-air sehingga kurva adisi pada hasil clean-up tidak berbeda signifikan dari kurva baku eksternal.

3. Mengetahui validitas metode analisis PPD dalam pewarna rambut oksidatif dengan ekstraksi larutan sodium metabisulfit pH 8 dan clean-up dengan C18-air.

5 BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA A. Pewarna Rambut

Sediaan pewarna rambut adalah sediaan kosmetik yang digunakan dalam tata rias rambut untuk mewarnai rambut atau untuk mengembalikan warna rambut asalnya (Dirjen POM, 1985). Pewarna rambut diklasifikasikan menjadi tiga jenis, yaitu pewarna rambut temporer, pewarna rambut semi-permanen, pewarna rambut permanen (Azis dan Muktiningsih, 1999).

Pewarna rambut permanen dikenal sebagai pewarna rambut oksidatif, dan penyusun utamanya adalah para-phenyelenediamine atau para-aminophenol. Pada umumnya, pewarna ini terdiri dari dua komponen yang harus dicampurkan ketika akan digunakan. Dua komponen tersebut adalah alkaline agent (colorant) dan hidrogen peroksida (developer). Alkaline agent memiliki efek membuka lapisan rambut luar sehingga agen pengoksidasi dapat lebih mudah terpenetrasi pada batang rambut. Selain alkaline agent, juga terdapat material yang disebut prekursor warna, yang berguna untuk membentuk warna baru. Agen pengoksidasi akan bereaksi dengan prekursor warna, dimana reaksi ini dikatalisis oleh alkaline agent dan akan menghasilkan oksigen. Selanjutnya, agen pengoksidasi akan menghilangkan warna alami dan terjadi pembentukan molekul berwarna oleh prekursor warna dalam korteks rambut. Molekul ini resisten terhadap pencucian sehingga dapat memberikan warna permanen. Oksigen yang dihasilkan akan meringankan pigmen melanin alami dalam rambut sehingga warna baru dapat

terlihat menggantikan warna alami rambut. Kebanyakan proses pewarnaan rambut meliputi dua proses yang berlangsung secara berkesinambungan, dimana pada awalnya terjadi penghilangan warna alami rambut, diikuti proses pemberian warna baru (Helmenstine, 2003). Para-phenylendiamine (PPD) atau disebut juga 1,4-diaminobenzen atau 1,4-fenilendiamin adalah suatu amin aromatik yang digunakan dalam hampir setiap cat rambut di pasaran (Pardede, Nababan, dan Mahadi, 2008). Komposisi pewarna rambut oksidatif pada penelitian ini terdiri dari:

1. Para-phenylendiamine (PPD)

Gambar 1. Struktur p-Phenylenediamine (National Center for Biotechnology Information, 2015)

PPD digunakan dalam cat rambut karena memberikan hasil yang tampak alami, menguatkan warna yang gelap dan warnanya tahan lama. PPD juga dapat dijumpai pada pewarna pakaian dan bulu, kosmetik, tato temporer, tinta, karet hitam, minyak dan pelumas. PPD yang terdapat dalam cat rambut biasanya dalam konsentrasi 6% (Pardede, Nababan, dan Mahadi, 2008). Berdasarkan Daftar Bahan yang Diizinkan Digunakan dalam Kosmetik dengan Pembatasan dan Persyaratan Penggunaan pada Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia Nomor HK.00.05.42.1018

tentang Bahan Kosmetik (2008), kadar maksimum PPD yang diperbolehkan dalam pewarna rambut adalah 6%.

PPD memiliki bobot molekul 108,14 g/mol, berwujud serbuk kristal berwarna putih hingga sedikit merah, dan dapat menjadi lebih gelap saat terpapar udara (United States Department of Labor, 1991).

PPD memiliki titik didih 267oC, titik leleh145-147oC, densitas >1, dan log Kow -0,25. PPD dapat larut dalam 100 bagian air, larut dalam alkohol, kloroform, ether, dan larut dalam benzen panas. Kelarutan dalam air pada 25oC yaitu 4% (g/100 mL). Saat terpapar udara, PPD teroksidasi menjadi warna ungu dan hitam. (National Center for Biotechnology Information, 2015). Panjang gelombang maksimum: 281.9 nm (Scientific Committee on Consumer Safety, 2012). PPD mempunyai dua nilai pKa yaitu 6,42 dan 3,04 (ChemAxon, 2014).

2. Ekstrak henna (Lawsonia inermis)

Henna atau hina (Lawsonia inermis, famili Lythraceae) merupakan tanaman berbunga yang tumbuh di daerah sub-tropis dan tropis di Afrika dan Asia Selatan. Henna secara komersial dikembang biakkan di Moroko, Sudan, India, Pakistan, Yemen, dan negara lainnya.

Henna mengandung molekul pewarna, lawsone (2-hidroksi -1,4-naftokuinon). Molekul ini memiliki kemampuan untuk mengikat protein dan secara luas digunakan untuk mewarnai kulit (tato), rambut, kuku, dan untuk mewarnai kain dan wol. Warna yang dihasilkan kuning oranye sampai merah.

Untuk menghasilkan warna hitam, biasanya ditambahkan PPD sebagai pewarna oksidasi (Al-Suwaidi dan Ahmed, 2010).

3. Sodium Perborat Tetrahidrat

Gambar 2. Struktur molekul sodium perborat tetrahidrat (Chemical Books, 2010)

Sodium perborat tetrahidrat merupakan kristal putih yang tidak berbau dengan berat molekul 153,86 g/ mol dan berat jenis 1,73 g/ mL. pH dalam larutan 1% pada suhu 25oC adalah 10,2. Kelarutan sodium perborat tetrahidrat dalam air 21,5 g/L (18oC). Tekanan uap 6,2 mmHg pada suhu 20oC. Titik leleh pada suhu 65oC dan titik didih 130-150oC. pKa sodium perborat tetrahidrat yaitu 8,5 (FMC, 2006).

Menurut Scientific Committee on Consumer Safety (2010), sodium perborat dalam air pada suhu ruang mengalami kesetimbangan menjadi hidrogen peroksida dan sodium metaborat mengikuti persamaan reaksi sebagai berikut:

[NaBO2(OH)2 x 3 H2O]2 ⇆ 2NaBO2 + 2H2O2 + 6 H2O (1) 4. Asam Sitrat

Gambar 3. Struktur molekul asam sitrat (National Center for Biotechnology Information, 2015)

Asam sitrat berbentuk padat atau berupa serbuk kristal, tidak berbau, rasanya asam. Asam sitrat mempunyai berat molekul 192,12 g/mol, berat jenis 1,665 g/mL dan titik leleh 153oC. Asam sitrat lebih larut dalam air dengan log Kow = -1,7. Sangat larut di etanol, larut di eter, etil asetat, tidak larut dalam benzene dan kloroform (National Center for Biotechnology Information, 2015). 5. Ekstrak Acacia concina

Acacia concina berasal dari family Acaciaceae, dikenal dengan sebutan buah untuk rambut. Acacia concina biasa digunakan sebagai perawatan untuk rambut di India. Bagian tanaman yang biasa digunakan untuk ekstrak yaitu kulit pohon dan buah. Tanaman ini sudah biasa ditemukan di hutan di India.

Kulit pohonnya mempunyai kandungan saponin yang tinggi yang merupakan foaming agent. Selain saponin terdapat juga kandungan alkaloid, flavonoid, fitosterol, tannin, senyawa fenolic, gum, dan mucilage (Todkar, Chavan, and Kulkarni, 2010).

6. Ekstrak Emblica officinalis

Emblica officinalis biasa disebut dengan Indian Gooseberry. Di India tanaman ini dikenal dengan sebutan amla yang digunakan untuk pengobatan ayurveda. Amla dapat ditemukan di atas ketinggian 5000 kaki di India. Bagian yang biasa digunakan dalam tanaman ini yaitu buah segar, buah kering, daun, daun, biji, akar, kulit batang dan bunga.

Tanaman ini mempunyai banyak manfaat yaitu untuk penambah daya tahan tubuh, mengontrol diabetes, gangguan respirasi, kelainan jantung, kelainan mata, untuk diet, anti-aging, batuk-batuk, diare, dan sebagai tonik

rambut. Pada penggunaan untuk rambut amla berfungsi untuk membantu pertumbuhan rambut dan pigmentasi. Bagian yang digunakan untuk rambut yaitu bagian buah. Kandungan kimia yang terdapat dalam tanaman ini yaitu apigenin, asam galat, asam elagat, asam chebulinic, kuarsetin, asam chebulagic, corilagin, isostrictiniin, metil galate, and luteolin (Kumar et. al., 2012).

B. Solid Phase Extraction (SPE)

SPE merupakan metode praperlakuan sampel atau untuk clean-up sampel seperti sampel yang mengandung garam-garam, protein, polimer, resin, dan lain-lain. Ada dua strategi dalam SPE yaitu (1) dengan melakukan pemilihan pelarut yang mampu menahan semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan, sementara untuk senyawa - senyawa penganggu akan terelusi (2) dengan mengusahakan supaya analit yang tertuju keluar (terelusi), sementara untuk senyawa penganggu tertahan pada penjerap (Gandjar dan Rohman, 2007).

Ada empat tahap dalam prosedur SPE, yaitu: a. Pengkondisian

Kolom dialiri dengan pelarut sampel untuk membasahi permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan dapat dihindari. Penjerap nonpolar dan penjerap penukar ion dikondisikan dengan menggunakan metanol lalu dengan aquadest. Penjerap - penjerap polar seperti diol, siano, amino, dan silika harus dibilas dengan pelarut nonpolar seperti metilen klorida.

b. Retensi sampel

Larutan sampel dilewatkan ke kolom baik untuk menahan analit yang diharapkan, sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan komponen yang tidak diharapkan sementara analit yang diharapkan terelusi.

c. Pembilasan

Tahap ini bertujuan untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.

d. Elusi

Tahap terakhir untuk mengambil analit yang dikehendaki jika analit tersebut tertahan pada penjerap

(Gandjar dan Rohman, 2007). C. Kromatografi

Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang menggunakan fase diam dan fase gerak. Teknik kromatografi digunakan untuk memisahkan dan

mengkuantifikasi berbagai macam komponen, baik komponen organik maupun komponen anorganik (Gandjar dan Rohman, 2007).

Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi pasangan ion, kromatografi penukar ion, kromatografi eksklusi ukuran, dan kromatografi afinitas. Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, yang keduanya sering disebut dengan kromatografi planar, kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (Gandjar dan Rohman, 2007).

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT merupakan teknik yang sering digunakan dalam analisis kimia dengan kemampuannya dalam memisahkan, menganalisis dan memurnikan suatu senyawa. Karakter KCKT adalah dengan menggunakan pompa bertekanan tinggi untuk mempercepat pemisahan, kolom yang dapat disesuaikan dalam memisahkan senyawa, kolom yang dapat digunakan berulang kali, serta hasilnya lebih presisi dan reprodusibel (Snyder, Kirkland, and Dorlan, 2010).

Sejumlah bidang yang menggunakan KCKT antara lain farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. KCKT merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif. Kelemahan metode KCKT ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa

(MS) dan jika sampel sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Gandjar dan Rohman, 2007).

KCKT merupakan teknik dimana solute-solut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, karena solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam. Keberhasilan dalam menggunakan metode KCKT dipengaruhi pemilihan jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).

Instrumen standar yang digunakan dalam KCKT meliputi: 1. Wadah fase gerak.

2. Pompa yang mampu memompa fase gerak > 4000 psi dan menghasilkan laju alir > 10 ml/menit.

3. Loop injector (standar yang sering digunakan adalah 20 µ L).

Gambar 4. Instrumen standar dalam KCKT (Watson, 1999)

4. Kolom yang biasanya dikemas dalam tabung stainless steel dengan berbagai jenis fase diam yang dapat disesuaikan.

5. Detektor yang biasanya merupakan detektor UV/visibel.

6. Sistem perekam data, dapat berupa integrator atau PC software yang sesuai untuk memproses data kromatogram.

7. Tabung penghubung di antara injektor dan detektor dengan narrow diameter internal < 0,2 mm.

8. Instrumen yang lebih canggih mungkin memiliki sistem injeksi sampel otomatis, memiliki oven untuk kolom, dan mampu mencampur dua atau lebih fase gerak dengan berbagai proporsi

(Watson, 1999). E. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah proses yang dibutuhkan memastikan kualitas dan kepercayaan suatu hasil analisis (Ermer dan Miller, 2005). Suatu metode analisis harus divalidasi untuk memastikan bahwa parameter-parameter kinerjanya mampu untuk mengatasi masalah analisis. Suatu metode harus divalidasi ketika:

1. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi masalah analisis tertentu

2. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau ada masalah yang mengharuskan metode tersebut direvisi

3. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah 4. Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, oleh analis yang

berbeda, atau oleh instrument yang berbeda

5. Mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara metode baku dan metode baru (Gandjar dan Rohman, 2007).

Parameter-parameter validasi metode analisis dalam penelitian ini meliputi:

1. Spesifisitas. Spesifisitas adalah kemampuan membedakan analit yang dituju dengan senyawa lain yang ada dalam sampel (ICH Harmonised Tripartite, 2005).

2. Linearitas. Linearitas adalah kemampuan suatu prosedur analisis untuk mengasilkan respon yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel (Ermer dan Miller, 2005).

3. Sensitifitas. Sensitifitas dapat dilihat dari nilai detection limit (DL) dan

quantitation limit (QL). DL adalah jumlah analit terendah dalam sampel yang dapat dideteksi namun tidak harus dikuantitasi. QL adalah jumlah analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima dengan metode analisis yang (ICH Harmonised Tripartite, 2005).

4. Akurasi. Akurasi suatu prosedur analisis merupakan kedekatan antara nilai yang sebenarnya dengan nilai yang ditemukan dalam pengujian (Ermer dan Miller, 2005).

5. Presisi. Presisi suatu prosedur analisis adalah kedekatan nilai yang diperoleh antar seri pengukuran yang diperoleh dari sampel homogen yang sama pada kondisi yang ditentukan. Presisi dapat dibagi menjadi tiga yaitu keterulangan, presisi intermediet, dan reprodusibilitas. Keterulangan adalah presisi pada kondisi operasional yang sama dalam jangka pendek. Presisi intermediet adalah presisi pada saat laboratorium sama namun berbeda hari, berbeda

peneliti, berbeda instrument, dan lain-lain. Reprodusibilitas adalah presisi antar laboratorium (ICH Harmonised Tripartite, 2005).

F. Landasan Teori

Para-phenylenediamine (PPD) merupakan salah satu komponen utama yang digunakan dalam pewarna rambut oksidatif. Dalam penggunaan jangka pendek atau jangka panjang PPD dapat menimbulkan efek yang tidak diinginkan. Penggunaannya dalam jangka pendek dapat menimbulkan sensitisasi, dermatitis, mata iritasi dan berair, asma, gastritis, gagal ginjal, vertigo, tremor, kejang, dan koma pada manusia. Sedangkan penggunaan jangka panjang dapat menimbulkan dermatitis kontak eczematous dan kanker pada manusia. Menurut Dirjen POM RI (2008), kadar PPD yang diperbolehkan dalam suatu sediaan pewarna rambut sebesar 6%. Namun, dalam kenyataannya banyak sediaan pewarna rambut yang tidak mencantumkan kadar PPD yang ditambahkan dalam produknya.

Pada penelitian ini akan dilakukan validasi metode analisis PPD dalam pewarna rambut oksidatif. Metode yang valid selanjutnya dapat digunakan untuk penetapan kadar PPD dalam pewarna rambut oksidatif sebagai salah satu sarana penunjang penjaminan keamanan bagi pengguna. Komponen pewarna rambut oksidatif yang diteliti terdiri atas PPD dan sodium perborat tetrahidrat serta memiliki matriks yang kompleks yang terdiri dari ekstrak henna, ekstrak acacia concina ,ekstrak emblica officinalis, dan asam sitrat sehingga diperlukan metode pemisahan yang sesuai. Pemisahan PPD dari matriks sampelnya dilakukan dengan ekstraksi solven air (kelarutan PPD dalam air pada 25oC sebesar 4% b/v) yang mengandung antioksidan, kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi. Setelah

itu, dilakukan clean-up menggunakan SPE C18 untuk memisahkan PPD dari ko-ekstraktan yang mengganggu. PPD yang dielusi dengan air akan langsung terelusi sementara matriks sampel akan tertahan dalam fase diam. Proses clean-up

diperlukan untuk memisahkan analit dari matriks sampel pengganggu sehingga determinasi PPD tidak terganggu.

Hasil clean-up diinjeksikan ke KCKT fase terbalik yang sudah dioptimasi (Emelia, 2015). Proses clean-up dikatakan berhasil apabila puncak PPD terpisah dari puncak lainnya. Metoda analisis yang dikembangkan merupakan metode analisis kuantitatif non-kompendial, maka parameter validasi meliputi spesifisitas, linearitas, akurasi, presisi, dan ketahanan.

G. Hipotesis

1. Matriks formulasi pewarna rambut terdiri dari campuran yang kompleks sehingga perlu dilakukan clean-up dengan metode pemisahan yang sesuai. 2. Ko-ekstraktan tertahan pada sistem SPE C18-air sehingga kurva adisi pada

hasil clean-up tidak berbeda signifikan dari kurva baku eksternal.

3. Metode analisis PPD dalam pewarna rambut oksidatif dengan ekstraksi larutan sodium metabisulfit pH 8 dan clean-up C18-air dapat memenuhi kriteria validitas yang diperlukan.

18 BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian ini adalah eksperimental karena terdapat perlakuan terhadap subjek uji.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah volume loading ekstrak sampel ke kolom SPE dan massa adisi PPD yang diadisikan ke sampel dan ke esktrak sampel.

2. Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah waktu retensi, resolusi, % perolehan kembali metode SPE C18, koefisien korelasi (r) antara massa total PPD dan AUC, slope kurva baku adisi, koefisien variansi (CV) dan % perolehan kembali metode standar adisi.

3. Variabel pengacau terkendali

Kemurnian pelarut yang digunakan, dapat diatasi dengan menggunakan pelarut pro analysis yang memiliki kemurnian tinggi.

C. Definisi Operasional

1. Para-phenylendiamine yang dianalisis adalah senyawa aktif yang berada dalam sampel pewarna rambut oksidatif.

2. Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) yang dipergunakan adalah seperangkat alat KCKT fase terbalik dengan jenis fase diam C18, suhu kolom, komposisi fase gerak, serta flowrate yang optimum.

3. Solid phase extraction (SPE) adalah teknik pemisahan analit dari matriks sampelnya menggunakan fase diam berbentuk padat. SPE yang digunakan adalah SPE C18.

4. Parameter validasi metode clean-up PPD dengan SPE adalah linearitas yang dilihat dari koefisien korelasi (r) dan akurasi yang dilihat dari % perolehan kembali.

5. Parameter validasi metode penetapan kadar PPD dengan KCKT adalah linearitas yang dilihat dari koefisien korelasi (r), sensitivitas yang dilihat dari

slope, presisi yang dilihat dari koefisien variansi (CV) dan akurasi yang dilihat dari % perolehan kembali.

6. Pelarut adalah cairan yang digunakan untuk melarutkan PPD atau sampel yaitu larutan sodium metabisulfit 0,1 M dan sodium metabisulfit 0,1 M pH 8. 7. Volume loading ekstrak sampel adalah volume ekstrak sampel yang

ditambahkan pada SPE pada saat retensi sampel. D. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku p-phenylenediamine (Sigma Aldrich), pewarna rambut oksidatif, metanol,

asetonitril, larutan amonia 25% dengan kualitas pro analysis (E. Merck), sodium metabisulfit (E. Merck), aquadest.

E. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik (OHAUS

Pioneer™ PA214), instrumen KCKT yang meliputi injektor (Rheodyne 7125;

Loop 20µL), pompa (Waters Model 510) dengan sistem elusi isokratik, detektor (Waters Associates Model 441), kolom C-18 (Shinwa Chemical Industries, LTD STR ODS – II; dimensi 150 x 4,0 mm; 5µm), seperangkat komputer dengan CBM (Shimadzu 102) dan perangkat lunak (Shimadzu Labsolutions: GC solution versi 2.30.00SU4, alat ultrasonifikasi (Branson 3510), alat sentifugasi (MSE 0682A), desilator aquabidest (Thermo Scientific), organic and anorganic solvent membrane filter (Whatman) dengan ukuran pori 0,45 m, syringe, mikropipet (Socorex), milipore filter, pH meter (Hanna), indikator pH universal (E.Merck), tabung mikrosentrifus 1,5 mL (Eppendorf) dan seperangkat alat-alat gelas (Pyrex).

F. Tata Cara Penelitian 1. Penyiapan sampel pewarna rambut oksidatif

Dua puluh bungkus pewarna rambut oksidatif disiapkan. Serbuk pewarna rambut ditimbang satu per satu untuk pengujian keseragaman bobot. Setelah dilakukan uji keseragaman bobot kemudian serbuk pewarna rambut dihomogenkan dengan menggunakan mortir dan stamper. Serbuk yang sudah dihomogenkan disimpan dalam wadah yang kering, tertutup rapat, dan dimasukkan ke lemari pendingin.

2. Pembuatan larutan sodium metabisulfit 0,01 M

sodium metabisulfit sebanyak 1,9 g ditimbang dan dilarutkan dalam aquadest yang telah disaring dengan kertas Whatman hingga 1 L.

3. Pembuatan larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8

Larutan sodium metabisulfit 0,01 M ditambah dengan larutan ammonia 10 % sedikit demi sedikit sampai larutan mencapai pH 8.

4. Pembuatan fase gerak untuk KCKT

Aquadest sebanyak 90 mL yang telah ditambah amonia 10% sebanyak 100 µL dicampurkan dengan asetonitril sebanyak 10 mL. Fase gerak disaring menggunakan kertas saring Whatman dengan dibantu pompa vakum kemudian gas dihilangkan dengan ultrasonifikasi selama 20 menit.

5. Validasi metode pengukuran PPD dengan KCKT

a. Pembuatan larutan stok baku PPD 2 mg/mL. Larutan stok baku PPD dibuat dengan konsentrasi 2 mg/mL dengan menggunakan pelarut larutan natrium metabisulfit 0,01 M.

b. Pembuatan larutan intermediet PPD 40 µg/mL. Larutan intermediet PPD dengan konsentrasi 40 g/mL dibuat dengan pengenceran stok baku PPD dengan konsentrasi 2 mg/mL. Pengenceran menggunakan pelarut natrium metabisulfit 0,01 M.

c. Pembuatan larutan seri baku PPD. Seri konsentrasi larutan PPD 1, 2, 3, 4, 6, 8, dan 10 ng/µ L dibuat dengan mengencerkan larutan intermediet PPD dengan fase gerak KCKT. Larutan seri konsentrasi PPD diinjeksikan ke dalam KCKT fase terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak ACN : aquades/ ammonium hidroksida 10% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/ menit, detektor UV dengan panjang gelombang 254 nm sesuai dengan hasil optimasi Emelia (2015).

6. Identifikasi para-phenylenediamine (PPD) dalam pewarna rambut dan perbandingan ekstrak sampel pewarna rambut sebelum dan sesudah

clean-up dengan SPE C18 dengan KCKT

Pada penelitian ini dilakukan identifikasi dalam sampel pewarna rambut dengan menggunakan KCKT. Cara yang dilakukan yaitu dengan membandingkan waktu retensi dan bentuk puncak antara baku PPD dan sampel pewarna rambut untuk mengetahui apakah dalam sampel pewarna rambut terdapat PPD.

a. Ekstraksi PPD dari pewarna rambut. Sampel pewarna rambut oksidatif yang telah dihomogenkan ditimbang seksama lebih kurang 300 mg, dimasukkan dalam tabung sentrifus, ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Suspensi dikocok dan disentifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Endapan ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8, sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Langkah ini diulang sebanyak dua kali. Supernatan dalam labu takar 50 mL diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda. Sejumlah 1 mL larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL kemudian diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda.

b. Clean-up sampel dengan SPEC18. Sebelum digunakan SPE dialiri dengan 6 mL aquadest. Seratus mikroliter ekstrak sampel yang telah diencerkan dimasukkan ke dalam SPE, ditampung dalam tabung mikrosentrifus. Elusi

dilakukan dengan menggunakan 900 µL aquadest ditampung dalam tabung mikrosentrifus yang sama.

c. Identifikasi PPD dalam eluat hasil clean-up dengan SPE. Eluat disaring dengan menggunakan milipore dan diinjeksikan ke dalam sistem KCKT. Kromatogram dibandingkan dengan kromatogram baku PPD konsentrasi 8

g/mL.

d. Perbandingan antara sampel pewarna rambut oksidatif sebelum dan sesudah

clean-up dengan SPE C18. Sejumlah eluat SPE dan larutan dalam labu takar 10 mL diambil dan diinjeksikan dalam KCKT. Kromatogram keduanya dibandingkan.

7. Optimasi clean-up dengan SPE C18

Sebelum digunakan SPE dialiri dengan 6 mL aquadest. Sejumlah ekstrak sampel yang telah diencerkan dimasukkan ke dalam SPE, ditampung dalam tabung mikrosentrifus. Elusi dilakukan dengan menggunakan aquadest ditampung dalam tabung mikrosentrifus yang sama. Optimasi clean-up dilakukan dengan memvariasi volume loading sampel untuk mengetahui kapasitas SPE mengikat pengotor dalam sampel. Volume loading sampel yang digunakan 100 µL dan 1 mL. Hasil clean-up dianalisis dengan menggunakan KCKT. Kromatogram volume loading sampel dibandingkan jumlah dan besarnya puncak selain puncak PPD.

8. Validasi metode clean-up PPD dengan SPE C18

a. Ekstraksi PPD dari sampel pewarna rambut oksidatif. Sampel pewarna rambut oksidatif yang telah dihomogenkan ditimbang seksama lebih kurang

300 mg, dimasukkan dalam tabung sentrifus, ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Suspensi dikocok dan disentifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Endapan ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8, sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Langkah ini diulang sebanyak dua kali. Supernatan dalam labu takar 50 mL diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda. Sejumlah 1 mL larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL kemudian diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda.

b. Validasi metode clean-up PPD dengan SPE C18. Sebelum dilakukan clean-up, ke dalam masing-masing 300 µL ekstrak sampel yang telah diencerkan ditambah 0, 10, 20, 30, 40 dan 50 µL baku PPD di dalam tabung mikrosentrifus. Clean-up dilakukan dengan memasukkan 100, 103, 107, 110, 113 dan 117 µL dari masing-masing tabung mikrosentrifus . Elusi dilakukan dengan 900, 897, 893, 890, 887 dan 883 µL aquadest. Eluat disaring dengan menggunakan milipore dan diinjeksikan ke dalam KCKT. 9. Validasi metode penetapan kadar PPD dengan metode standar adisi

a. Pembuatan kurva baku adisi dalam matriks sampel pewarna rambut. Kurva baku adisi dibuat dengan menambahkan 2, 4, 7, 10, 15 dan 20 mg baku PPD ke dalam masing-masing 300 mg sampel pewarna rambut.

b. Ekstraksi PPD dalam sampel pewarna rambut. Masing-masing sampel dimasukkan dalam tabung sentrifus, ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Suspensi dikocok dan disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Endapan ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8, sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Langkah ini diulang sebanyak 2 kali. Supernatan dalam labu takar 50 mL diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda. Sejumlah 1 mL larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL kemudian diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda.

c. Clean-up sampel dengan SPEC18. Clean-up dilakukan sesuai dengan hasil optimasi langkah 7.

d. Determinasi PPD dengan KCKT. Eluat disaring dengan menggunakan

milipore dan diinjeksikan ke dalam KCKT.

10. Penetapan kadar para-phenylenediamine (PPD) dalam pewarna rambut dengan metode standar adisi

Sampel pewarna rambut oksidatif yang telah dihomogenkan ditimbang seksama lebih kurang 300 mg, dimasukkan dalam tabung sentrifus, ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Suspensi dikocok dan disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Endapan ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8, sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan

3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Langkah ini diulang sebanyak 2 kali. Supernatan dalam labu takar 50 mL diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda. Sejumlah 1 mL larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL kemudian diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda. Clean-up dilakukan sesuai dengan hasil optimasi langkah 7. Eluat disaring dengan menggunakan milipore dan diinjeksikan ke dalam KCKT. Penetapan kadar dilakukan dengan metode standar adisi dengan menambahkan 2, 4, 7, 10, 15 dan 20 mg baku PPD ke dalam masing-masing 300 mg sampel pewarna rambut.

G. Analisis Hasil 1. Validasi metode pengukuran PPD dengan KCKT

Parameter validasi yang ditetapkan yaitu linearitas dan sensitivitas dengan melihat dari kurva baku PPD.

a. Linearitas. Linearitas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Luas area diplotkan terhadap massa PPD (minimum 5 konsentrasi) untuk memperoleh persamaan regresi linear dengan persamaan y = bx + a (ICH Harmonised Tripartite, 2005).

b. Sensitivitas. Sensitivitas dapat ditentukan dengan nilai slope, DL, dan QL. 1) Slope didapatkan dari persamaan regresi linear y= bx+a (b = slope; a =

intersep).

2) DL dapat dihitung dengan rumus:

Keterangan:

σ = standar deviasi dari respon S = slope kurva baku eksternal

3) LOQ dapat dihitung dengan rumus:

QL= 10 � (2)

Keterangan:

σ = standar deviasi dari respon

S = slope kurva baku eksternal

(ICH Harmonised Tripartite, 2005). 2. Analisis hasil identifikasi PPD dalam sampel pewarna rambut oksidatif

Data kromatogram antara sampel dan baku PPD dibandingkan (ICH Harmonised Tripartite, 2005).

3. Analisis hasil perbandingan sampel sebelum dan sesudah clean-up

dengan SPE C18

Data kromatogram antara sampel sebelum SPE dan sesudah SPE dibandingkan dan nilai resolusi antara puncak analit dan puncak terdekat dihitung (ICH Harmonised Tripartite, 2005).

Dalam KCKT, resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi dua puncak yang saling berdekatan dibagi dengan rata-rata lebar puncak. Resolusi (Rs) dapat dihitung dengan rumus:

Rs = 2∆

�1+�2 (3)

4. Analisis hasil optimasi clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18 Data kromatogram antara volume loading sampel 100 µL dan volume loading sampel 1000 µ L dibandingkan (ICH Harmonised Tripartite, 2005).

5. Validasi metode clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18

Parameter validasi yang ditetapkan yaitu linearitas, akurasi, dan presisi (keterulangan).

a. Linearitas. Linearitas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Luas area diplotkan terhadap massa total PPD yang ada dalam ekstrak pewarna rambut yang telah diadisi (minimum 5 konsentrasi) untuk memperoleh persamaan regresi linear dengan persamaan y = bx + a (ICH Harmonised Tripartite, 2005).

b. Akurasi. Akurasi dinyatakan dengan % perolehan kembali.

% perolehan kembali dapat dihitung dengan menggunakan rumus:

% perolehan kembali = − ( )

( � � � ℎ ) x 100% (4)

c. Presisi (keterulangan). Presisi (keterulangan) dinyatakan dengan nilai

coefficient of variation (CV). CV dihitung pada setiap replikasi. Rumus CV yaitu:

CV = � �

− x 100% (5)

5. Validasi penetapan kadar PPD dengan metode standar adisi

Parameter validasi yang ditetapkan yaitu linearitas, sensitivitas, akurasi dan presisi intermediet.

a. Linearitas. Linearitas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Luas area diplotkan terhadap massa total PPD yang ada dalam sampel pewarna

rambut yang telah diadisi (minimum 5 konsentrasi) untuk memperoleh persamaan regresi linear dengan persamaan y = bx + a.

b. Sensitivitas. Sensitivitas ditentukan dengan nilai slope. Slope didapatkan dari persamaan regresi linear y= bx+a (b = slope; a = intersep).

c. Akurasi. Akurasi dinyatakan dengan % perolehan kembali.

% perolehan kembali dapat dihitung dengan menggunakan rumus (4). d. Presisi intermediet. Presisi intermediet kurva baku adisi ditentukan dengan

uji signifikansi nilai slope 3 replikasi antarhari seri kurva baku adisi menggunakan ANOVA satu arah.

6. Pengaruh matriks pewarna rambut dalam penetapan kadar para-phenylenediamine (PPD)

Slope kurva baku dibandingkan dengan slope kurva baku adisi untuk mengetahui pengaruh matriks pada metode analisis PPD dalam pewarna rambut. Perbedaan slope dihitung melalui uji signifikansi (uji t).

7. Penetapan kadar para-phenylenediamine (PPD) dalam pewarna rambut dengan metode standar adisi

Penetapan kadar dihitung dengan persamaan kurva baku adisi. Besarnya kesalahan ditentukan dengan faktor ketidakpastian (µ).

30 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Para-phenylenediamine (PPD) adalah salah satu senyawa yang digunakan dalam pewarna rambut tipe oksidasi. Penggunaan PPD dalam pewarna rambut dapat menimbulkan alergi dan bahkan kanker. Menurut Dirjen POM RI (2008), batas konsentrasi kandungan PPD dalam sediaan pewarna rambut sebesar 6%, namun konsentrasi kandungan PPD dalam pewarna rambut tidak dicantumkan. Oleh karena itu, dalam penelitian ini peneliti ingin menetapkan validasi metode analisis PPD dalam pewarna rambut oksidatif. Penetapan kadar PPD dalam pewarna rambut oksidatif diawali dengan ekstraksi dengan solven air kemudian dilakukan clean-up dengan SPE C18 dan diinjeksikan dalam KCKT. Menurut Emelia (2015), metode KCKT memiliki validitas yang baik dengan persamaan regresi linear y= 2267,62792 x – 46155,41523; koefisien korelasi (r) = 0,9922, %CV= 2-11% ; LOD= 489 ng/mL.

A. Penyiapan sampel pewarna rambut oksidatif

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari enam toko yang ada di Yogyakarta. Sampel yang diambil berasal dari batch yang sama dengan tujuan sampel mengalami proses produksi yang sama sehingga lebih homogen. Sebelum sampel dianalisis, dilakukan uji keseragaman bobot untuk memastikan bahwa kadar senyawa PPD yang terkandung dalam setiap sediaan pewarna rambut seragam.

Uji keseragaman bobot dilakukan dengan cara menimbang satu per satu isi dari 20 bungkus, mencampurkan isi 20 bungkus tersebut dan ditimbang,

kemudian dihitung bobot rata-ratanya. Syarat penyimpangan terhadap penimbangan satu per satu terhadap bobot rata-rata tidak lebih dari 15% untuk 2 bungkus dan dan tidak lebih dari 10% untuk 18 bungkus (Syamsuni, 2005).

Bobot rata-rata hasil penimbangan 20 bungkus yaitu 9,0 g. Data hasil penimbangan (Lampiran 2) menunjukkan ada 7 kemasan yang bobotnya menyimpang lebih dari 10% dari bobot rata-rata dan 3 kemasan yang bobotnya lebih dari 15% dari bobot rata-rata. Oleh karena itu, pewarna rambut oksidatif yang digunakan dalam penelitian ini tidak memenuhi syarat keseragaman bobot.

PPD merupakan senyawa yang mudah teroksidasi (tidak stabil) saat terpapar dengan udara. Sehingga perlu dilakukan penjaminan agar metode tetap

robust dengan cara sampel disimpan dengan mengalirkan gas nitrogen ke dalam wadah kemudian ditutup dengan rapat dan disimpan dalam lemari pendingin. PPD akan teroksidasi saat terpapar udara, sehingga diperlukan nitrogen untuk menggantikan posisi udara dalam wadah dan ditutup rapat untuk mencegah masuknya udara. Wadah disimpan dalam lemari pendingin untuk menjaga kestabilan sampel.

B. Validasi metode pengukuran PPD dengan KCKT

Validasi metode pengukuran adalah suatu prosedur penjaminan bahwa metode pengukuran yang digunakan dapat dipercaya dan diterima sehingga dapat digunakan untuk pengukuran tertentu. Validasi metode pengukuran dilakukan dengan pembuatan kurva baku PPD. Parameter validasi yang digunakan yaitu linearitas dan sensitivitas.

Pembuatan kurva baku PPD bertujuan untuk mengetahui apakah hubungan antara massa analit dan respon instrumen linear. Larutan seri konsentrasi PPD yang digunakan yaitu 1, 2, 3, 4, 6, 8, dan 10 ng/µL. Pelarut yang digunakan dalam pembuatan kurva baku adalah air yang diberi antioksidan sodium metabisulfit untuk mencegah oksidasi PPD. Persamaan regresi linear yang didapat merupakan hubungan antara massa PPD dan respon instrumen.

Hubungan antara seri massa baku dan respon instrumen ditunjukkan oleh Gambar 1 dengan nilai slope = 2699,1; intercept = - 101178 dan r = 0,9855. Hasil tersebut menunjukkan hubungan antara massa baku PPD dan respon instrumen linear dan dapat digunakan dalam penelitian ini.

Gambar 6. Kurva hubungan seri massa baku PPD dan respon instrumen (AUC) Linearitas merupakan kemampuan metode analisis dalam memberikan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan (Gandjar dan Rohman, 2007). Batasan koefisien korelasi yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan batasan dari Pearson’s correlation

coefficient test yang dapat dilihat pada Lampiran. Linearitas dinyatakan dalam nilai koefisien korelasi (r), dimana koefisien korelasi memiliki hubungan dengan

-100000 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000

0 100 200 300 400

AUC

banyaknya determinasi yang dilakukan (n). Bila r yang didapat dari regresi linear nilainya lebih besar daripada yang ada pada tabel, maka secara statistik hubungan linearitas pada kurva baku sudah terpenuhi.

Pada penelitian ini juga dilakukan uji linearitas pada hari yang berbeda untuk memastikan bahwa instrumen yang digunakan tetap valid meskipun dilakukan pada hari yang berbeda. Hal ini dilakukan karena berdasarkan pengalaman selama penelitian PPD mudah teroksidasi. Hasil uji linearitas ditunjukkan pada Tabel I.

Tabel I. Nilai r dan n kurva baku eksternal PPD Replikasi r penelitian n r tabel

1 0,9941 7 0,754

2 0,9974 6

0,811

3 0,9925 6

4 0,9956 5 0,878

r kumulatif 0,9855 24 0,404

Tabel I menunjukkan bahwa r kurva baku PPD sudah memenuhi parameter linearitas dalam tabel Pearson’s correlation coefficient test, sehingga hubungan antara massa PPD dan respon instrumen dinyatakan linear secara statistik.

Sensitivitas dapat dinyatakan dengan nilai slope, paramater detectionlimit

(DL) dan quantification limit (QL). Semakin besar nilai slope maka semakin baik sensitivitas, semakin kecil nilai DL dan QL semakin baik sensitivitas. Nilai slope

kumulatif yang diperoleh yaitu 2699,1. Nilai DL dan QL yang didapat secara berturut-turut yaitu 686 - 942 ng/mL dan 2288 – 3138 ng/mL.

C. Identifikasi para-phenylenediamine dalam pewarna rambut oksidatif Identifikasi PPD dalam sampel pewarna rambut oksidatif perlu dilakukan dilakukan untuk mengetahui apakah di dalam pewarna rambut oksidatif yang digunakan terdapat PPD atau tidak. Identifikasi dilakukan dengan membandingkan kromatogram antara baku PPD dan sampel pewarna rambut oksidatif. Pada metode KCKT, diperlukan sampel yang analitnya sudah terpisah dari ko-ekstraktan dalam sampel agar tidak mengganggu determinasi analit, oleh karena itu dilakukan clean-up dengan Solid Phase Extraction (SPE). Berikut perbandingan puncak antara pelarut, baku PPD dan sampel:

Gambar 7. Kromatogram dengan fase diam C18, fase gerak asetonitril:air (10:90), laju

alir = 0,5 mL/menit, volume inject 20 µL (A) Larutan sodium metabisulfit,tR = 2,147

menit (B) Baku PPD 8 g/mL, tR = 4,834 menit (C) Sampel pewarna rambut oksidatif

setelah clean-up, tR PPD = 4,872 menit

Gambar 7 menunjukkan bahwa dalam sampel pewarna rambut oksidatif terdapat PPD yang ditunjukkan oleh adanya waktu retensi (tR) yang sama pada kromatogram baku PPD dan sampel yaitu pada tR 4,8 menit (Gambar 7B dan 7C).

A

B

Puncak yang muncul di sekitar tR1,9 – 2,1 menit adalah puncak dari pelarut yang digunakan yaitu sodium metabisulfit yang dibuktikan oleh Gambar 7A.

D. Perbandingan antara ekstrak sampel pewarna rambut sebelum dan sesudah clean-up dengan SPE C18

Formulasi pewarna rambut oksidatif dalam penelitian ini mempunyai komposisi yang kompleks yaitu PPD, sodium perborat tetrahidrat, ekstrak henna, ekstrak Acacia concina, ekstrakEmblica officinalis, dan asam sitrat. Oleh karena itu, dibutuhkan proses clean-up dengan SPE yang bertujuan untuk memisahkan PPD dari matriks sampel (ko-ekstraktan) yang mengganggu dalam deteksi analit. Pada penelitian ini dibandingkan antara ekstrak sampel sebelum dan sesudah dilakukan clean-up dengan SPE C18 untuk melihat apakah metode clean-up

Gambar 8. Kromatogram dengan fase diam C18, fase gerak asetonitril:air (10:90), laju alir

= 0,5 mL/menit, volume inject 20 µL (A) ekstrak sampel sebelum dilakukan clean-up dengan

SPE C18, (B) Ekstrak sampel sesudah dilakukan clean-up dengan SPE C18

Gambar 8 menunjukkan bahwa clean-up dengan SPE C18 dapat memisahkan PPD dari matriks sampel yang mengganggu dalam determinasinya. Pada Gambar 8B dapat dilihat puncak PPD muncul pada tR 4,8 menit dan

terpisah dari puncak lainnya dengan resolusi ≥ 1,5. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan sudah memenuhi parameter spesifisitas.

E. Optimasi clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18

Ekstraksi merupakan proses untuk mengambil analit yang dituju dari matriks sampelnya. Ekstraksi yang dilakukan menggunakan pelarut air yang diberi antioksidan sodium metabisulfit pada pH 8. Sodium metabisulfit dipilih

A

sebagai antioksidan karena merupakan antioksidan yang kuat dan stabil sehingga dapat mencegah oksidasi PPD. PPD merupakan senyawa yang bersifat basa lemah dengan pKa 6,42 dan 3,04. Menurut Corbett (1972), laju auto-oksidasi PPD minimal terjadi saat pH 8, oleh karena itu digunakan pelarut dengan pH 8 untuk meminimalkan auto-oksidasi pada PPD dan sekaligus untuk membuat PPD dalam bentuk molekulnya. Endapan dan cairan solven dipisahkan dengan teknik sentrifugasi.

Metode sentrifugasi dapat memisahkan PPD yang terekstrak dengan matriks sampel dengan proses yang memanfaatkan gaya sentrifugal untuk sedimentasi campuran. Komponen yang mempunyai massa jenis lebih besar akan mengendap, menyisakan cairan supernatan yang mudah diambil. PPD akan berada dalam larutan supernatan karena PPD larut dalam air.

Clean-up merupakan praperlakukan sampel yang bertujuan untuk memisahkan analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin menganggu pada saat pengukuran atau deteksi analit. Pada penelitian ini clean-up dilakukan dengan metode solid phase extraction (SPE) karena praktis dan hemat pelarut (Watson, 1999). Strategi yang digunakan dalam clean-up dengan SPE ada 2 macam yaitu dengan memilih pelarut yang mampu mengelusi analit sehingga analit tertahan pada penjerap dan komponen pengganggu terelusi atau dengan memilih pelarut yang langsung dapat mengelusi analit sementara komponen pengganggu tertahan dalam penjerap.

Pemilihan jenis SPE yang digunakan berdasarkan skema yang terdapat dalam Gambar 9. Pada penelitian ini, matriks sampel bersifat aqueous karena

digunakan air sebagai pelarut sampel. PPD bersifat polar dengan log Kow -0,25 sehingga PPD mudah larut dalam air. PPD bersifat basa lemah sehingga pH perlu dijaga dengan cara membuat pH pelarut menjadi pH 8 untuk menjaga PPD tetap dalam bentuk molekulnya (netral). Oleh karena itu, PPD akan sulit tertahan dalam penjerap sehingga diperlukan penjerap yang mampu menahan komponen pengotornya.

Gambar 9. Skema untuk pemilihan jenis SPE (Sigma-Aldrich, 1998).

Komponen-komponen yang kemungkinan terjerap adalah senyawa-senyawa dalam ekstrak henna, ekstrak Acacia concina dan ekstrak Emblica

officinalis. Sodium perborat tetrahidrat dan asam sitrat akan langsung terelusi. Berdasarkan skema tersebut, maka SPE yang digunakan dalam penelitian ini yaitu SPE C18. Strategi dalam SPE yang digunakan yaitu dengan menahan komponen pengotor pada penjerap sementara PPD langsung terelusi. SPE yang digunakan bersifat sangat nonpolar karena sudah di-endcapped dengan C18. Oleh karena itu, PPD akan langsung terelusi sementara komponen pengotor akan tertahan dalam penjerap.

Menurut Watson (1999), pengkondisian SPE perlu dilakukan dengan menggunakan pelarut sampel dengan volume 5-10 kali volume fase diam. Pengkondisian bertujuan untuk membasahi permukaan fase diam dan untuk menciptakan nilai pH yang sesuai sehingga perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan dapat dihindari. Setelah dilakukan pengkondisian, ekstrak sampel dimasukkan dalam SPE (loading). Untuk memperoleh hasil yang optimal maka dilakukan optimasi volume loading ekstrak sampel.

Pada penelitian ini, optimasi volume loading ekstrak sampel dilakukan untuk melihat kapasitas SPE dalam mengikat pengotor pada sampel. Kemampuan penjerap dalam menahan pengotor yang ada di dalam sampel dapat diketahui dengan memvariasi banyaknya pengotor dengan cara merubah volume larutan sampel yang dimasukkan dalam SPE. Variasi volume loading ekstrak sampel yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 100 µL dan 1 mL. Eluat hasil SPE kemudian ditampung dalam tabung mikrosentrifus dan disaring dengan milipore dan

diinjeksikan dalam KCKT. Hasil optimasi volume loading ekstrak sampel ditunjukkan oleh Gambar 10.

Gambar 10. Kromatogram dengan fase diam C18, fase gerak asetonitril:air

(10:90), laju alir = 0,5 mL/menit, volume inject 20 µL (A) Volume loading sampel 100 µL, (B)

Volume loading sampel 1 mL, (C) Baku PPD 8 g/mL

Gambar 10 menunjukkan bahwa puncak PPD muncul pada tR sekitar 4,8 menit dan puncak sodium metabisulfit muncul pada tR sekitar 1,9 menit. Jika

A

B

dilihat dari kromatogram di atas dapat disimpulkan bahwa volume loading sampel 100 µL lebih baik dibandingkan volume loading sampel 1 mL karena pada volume loading sampel 100 µL puncak yang dihasilkan lebih sedikit daripada volume loading sampel 1 mL. Jumlah puncak lebih sedikit berarti jumlah pengotor lebih sedikit yang disebabkan karena pengotor dapat tertahan pada penjerap (kapasitas SPE belum terlampaui). Kromatogram volume loading sampel 1 mL menghasilkan puncak yang banyak. Jumlah puncak banyak berarti banyak pengotor yang ikut terelusi karena kapasitas SPE sudah terlampaui.

F. Validasi metode clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18

Validasi metode adalah suatu prosedur penjaminan bahwa metode yang digunakan dapat dipercaya dan diterima sehingga dapat digunakan untuk pengukuran tertentu. Validasi metode clean-up PPD dalam sampel dengan SPE bertujuan untuk memastikan bahwa metode SPE yang digunakan dalam penelitian memenuhi parameter validitas yaitu akurasi dan linearitas.

Uji linearitas metode clean-up dilakukan dengan meningkatkan jumlah PPD yang diadisikan ke dalam ekstrak sampel sehingga dapat diketahui apakah peningkatan adisi PPD diikuti dengan peningkatan respon instrumen secara linear. Hubungan antara seri massa adisi PPD dan respon instrument dapat dilihat dari Gambar 6 dengan nilai slope = 3286,7175; intercept = 153442,7028 dan r = 0,9783. Hasil tersebut menunjukkan bahwa peningkatan adisi PPD diikuti dengan peningkatan respon instrumen secara linear.

Gambar 11. Kurva hubungan antara seri massa adisi PPD dan respon instrumen metode

clean-up dengan SPE

Linearitas merupakan kemampuan metode analisis dalam memberikan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Batasan koefisien korelasi yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan batasan dari Pearson’s correlation coefficient test yang dapat dilihat pada Lampiran 3.

Tabel II. Nilai r dan n kurva baku adisi metode clean-up dengan SPE c18

Replikasi r penelitian n r tabel

1 0,9914

6 0,811

2 0,9813

3 0,9829

kumulatif 0,9783 18 0,468

Tabel II menunjukkan bahwa secara statistik hubungan antara massa adisi PPD dan respon instrumen metode clean-up dengan SPE linear.

Akurasi merupakan ketelitian metode atau kedekatan nilai terukur dengan nilai sebenarnya (Gandjar dan Rohman, 2007). Tujuan penghitungan %perolehan kembali yaitu untuk mengetahui seberapa besar PPD yang dapat

ter-0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000

0 50 100 150

AUC

cover selama proses clean – up dengan SPE C18. Hasil % perolehan kembali masing-masing adisi ditunjukkan oleh Tabel III.

Tabel III. Rata-rata % perolehan kembali dan nilai CV perolehan kembali metode SPE C18 Adisi PPD (µg/300µ L ekstrak sampel) Rata-rata perolehan kembali

(%)

CV (%)

4,004 81,77 16,23

8,008 76,41 39,50

12,012 93,83 22,75

16,016 94,89 6,59

20,02 103,61 20,37

Menurut AOAC (2012), kisaran % perolehan kembali yang diperbolehkan yaitu 80 – 110% dan nilai CV yang diperbolehkan yaitu 11%. Pada Tabel III, % perolehan kembali menunjukkan bahwa metode clean-up dengan SPE C18 akurat, sedangkan nilai CV menunjukkan bahwa nilai %perolehan kembali yang diperoleh tidak presisi.

G. Validasi metode penetapan kadar PPD dengan metode standar adisi Parameter validasi metode penetapan kadar PPD dalam pewarna rambut dengan KCKT yaitu linearitas, sensitivitas, akurasi, dan presisi. Metode standar adisi digunakan dengan alasan karena matriks sampel pewarna rambut sangat kompleks sehingga kemungkinan mempengaruhi analit dan tidak memungkinkan membuat blanko yang sama persis dengan sampel. Apabila ternyata matriks sampel memberikan pengaruh yang signifikan, maka penetapan kadar harus menggunakan kurva baku adisi. Metode standar adisi dilakukan dengan cara menambahkan sejumlah massa baku PPD secara bertingkat ke dalam sampel diawal sebelum preparasi sampel. Hasil preparasi diinjeksikan dalam KCKT.

Hubungan antara seri konsentrasi baku dan respon instrumen dapat dilihat dari Gambar 7 dengan nilai slope replikasi 1,2 dan 3 secara berturut-turut sebesar 2927,0, 2789,9 dan 2405,1; intercept replikasi 1,2 dan 3 secara berturut-turut sebesar 159718, 145902, dan 85574, dan nilai koefisien korelasi (r) replikasi 1, 2 dan 3 secara berturut-turut yaitu 0,9915, 0,9942 dan 0,9932. Hasil tersebut menunjukkan hubungan antara massa baku PPD dan respon instrumen linear.

Gambar 12. Kurva hubungan antara massa baku adisi PPD dan respon instrumen replikasi 1,2 dan 3

Uji linearitas metode penetapan kadar dengan metode standar adisi dilakukan sebanyak 3 kali replikasi (berbeda hari) untuk memastikan metode tetap valid setiap kali penetapan kadar dilakukan. Hasil uji linearitas dapat dilihat dalam Tabel IV.

Tabel IV. Nilai r dan n kurva baku adisi metode standar adisi Replikasi r penelitian n r tabel

1 0,9915

6 0,811

2 0,9942

3 0,9932

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000

0 20 40 60 80 100

AUC

Massa adisi PPD (ng/20 µL)

Tabel IV menunjukkan bahwa nilai r kurva baku adisi 3 replikasi sudah memenuhi parameter linearitas dalam tabel Pearson’s correlation coefficient test (Lampiran 3), sehingga kurva baku adisi yang digunakan sudah dinyatakan linear secara statistik.

Sensitivitas metode penetapan kadar PPD dengan metode standar adisi dapat ditentukan dari nilai slope. Nilai slope semakin besar berarti sensitivitas semakin baik. Pada penelitian ini didapatkan nilai slope 3 replikasi berturut-turut sebesar 2927,0; 2789,9; dan 2405,1.

Pada penelitian ini akurasi metode analisis PPD dihitung dari %perolehan kembali sampel yang ditambahkan dengan baku PPD dari awal proses preparasi. Persen perolehan kembali dapat dilihat dalam Tabel V.

Tabel V. Nilai % perolehan kembali dan nilai CV perolehan kembali metode penetapan kadar dengan metode standar adisi

Adisi PPD dalam 300 mg sampel (mg)

Rata-rata perolehan kembali (%)

CV (%)

2 180,0 85,6

4 132,0 37,6

7 126,6 21,8

10 121,9 35,0

15 104,4 14,5

20 122,7 22,7

Menurut AOAC (2012), kisaran % perolehan kembali yang diperbolehkan yaitu 80 - 110% dan nilai CV yang diperbolehkan yaitu 11%. Pada Tabel V, % perolehan kembali menunjukkan bahwa metode penetapan kadar dengan metode standar adisi tidak akurat dan nilai CV menunjukkan bahwa nilai %perolehan kembali yang diperoleh tidak presisi.

Lampiran 3. Tabel Hubungan n dan r (Pearson’s correlation coefficient test) (Wheater and Cook, 2000).

Lampiran 4. Perhitungan Resolusi (Rs)

Rs = 2∆ �1+�2

Rs antara puncak pengotor 1 dan puncak PPD = 2 ×1,8

0,4 +0,3 = 5,1 Rs antara puncak pengotor 2 dan puncak PPD = 2 ×1,75

0,3 +1,2 = 2,3

Pengotor 1

Pengotor 2 PPD

Lampiran 5. Persamaan regresi linear kurva baku eksternal replikasi 1, 2, 3, dan kumulatif

Lampiran 6. Kurva baku adisi metode clean-up dengan SPE C18 Massa adisi pada 20

µL ekstrak sampel (ng) AUC Replikasi 1 AUC Replikasi 2 AUC Replikasi 3 Persamaan regresi linear

kumulatif

0 141946,5 209605 166976,9

y = 3286,7175x + 153442,7028

r = 0,9783 27 217810,4 264595,1 240037,4

54 331509,3 302803,3 277932,7 80 429028,8 389585,3 416545,6 106 485722,2 523210,9 469780,1 134 662083,1 553598,9 628661,7 Replikasi Massa

(ng) AUC Persamaan Persamaan kumulatif

1

80,08 83185,6

y = 3179,1x - 196450 r = 0,9941

y = 2699,1x - 1011778 r = 0,9855 120,12 191579,7

160,16 304253 200,2 388906,2 240,24 549489,8 280,28 736209,8 320,32 826399,7

2

41,48 36219,9

y = 2349x - 64966 r = 0,9974 62,22 78005,6

82,96 125667,1 124,44 221902,8 165,92 344534,2 207,4 411584,2

3

20,04 16254,3

y = 1989,6x - 27127 r = 0,9925 40,08 62902,1

60,12 77957,1 80,16 12005,1 120,24 229876,9 160,32 287096,1

4

59,94 61061,8

y = 2633,6x - 110354 r = 0,9956 79,92 97611,1

119,88 192252,7 159,84 296902,4 199,8 431600,2

Lampiran 7. Perolehan kembali metode clean-up dengan SPE C18

Rumus % perolehan kembali = − ( )

( ���� � � ℎ ) × 100% Adisi PPD

(µg)/300uL ekstrak sampel

Perolehan kembali R1

Perolehan kembali R2

Perolehan

kembali R3 Rata-rata (%)

SD CV (%) (µg) % (µg) % (µg) %

4,0 3,6 91,0 2,7 66,6 3,5 87,8 81,8 13,3 16,2 8,0 8,9 110,7 4,3 54,0 5,2 64,5 76,4 30,2 39,5 12,0 13,5 112,8 8,5 70,7 11,8 98,0 93,8 21,3 22,8 16,0 16,3 101,9 14,9 93,0 14,4 89,8 94,9 6,3 6,6 20,0 24,4 122,0 16,1 80,6 21,7 108,3 103,6 21,1 20,4

Lampiran 8. Kurva baku metode standar adisi

Replikasi Massa PPD (ng/20µ L ) AUC Persamaan regresi linear

1

Tanpa adisi 146175,8

y = 2927,0x + 159718 r = 0,9915

8 194774,4

16 207803

28 234421,7

40 291708,2

80 388873,8

2

Tanpa adisi 139188,9

y = 2789,9x + 145902 r = 0,9942

8 183474

16 188748,4

28 222425,7

40 248539,8

80 373095,5

3

Tanpa adisi 90096,3

y = 2405,1x + 85574 r = 0,9932

16 121602

28 160899,9

40 167691,4

60 227813,4

Lampiran 9. Perhitungan uji signifikansi slope kurva baku adisi 3 replikasi dengan ANOVA satu arah

F hitung = MS between/ MS within

Slope s s2 df

Replikasi 1 2926.96 191.82 36796.06 5

Replikasi 2 2789.95 150.76 22728.28 5

Replikasi 3 2405.09 140.44 19723.67 5

MS

within 26416.00 15

s 270.57

s2 73206.85

df 2 F hitung 5.54

MS

between 146413.70 Ftable 3.68

Lampiran 10. Perolehan kembali dengan metode standar adisi Adisi PPD

(mg)/300 mg sampel

Perolehan kembali R1

Perolehan kembali R2

Perolehan

kembali R3 Rata-rata (%)

SD CV

(%)

(µg) % (µg) % (µg) %

2 5,2 259,1 5,6 278,5 0,04 2,5 180,0 154,0 85,6 4 6,6 164,1 6,3 157,0 3,0 74,8 132,0 49,6 37,6 7 9,4 134,3 10,5 149,7 6,7 96,0 126,6 27,6 21,8 10 15,5 154,6 13,7 137,4 7,4 73,6 121,9 42,6 35,0 15 17,3 114,7 16,7 111,5 13,1 87,0 104,4 15,1 14,5 20 25,9 128,9 29,4 146,9 18,5 92,3 122,7 27,8 22,7

Lampiran 11. Penetapan kadar PPD dalam sampel pewarna rambut oksidatif dengan metode standar adisi

Persamaan regresi linear yaitu y = bx + a (b = slope; a = intersep)

Replikasi Persamaan regresi linear

Massa PPD (ng/20uL)

Massa PPD (mg/50 mL)

Massa PPD (mg/mg)

Kadar PPD

(%) 1 y = 2927,0x + 15971 55 13,6418 0,0454 4,54 2 y = 2789,9x +

145902 52 13,0741 0,0436 4,36

3 y = 2450,1x + 85574 36 8,8951 0,0296 2,96

Lampiran 13. Uji signifikansi (uji t) antara slope kurva baku eksternal dan kurva baku adisi

Rumus:

s

=

1−1 1²+ 2−1 2²

( 1+ 2−2)

t = 1− 2 1

1+ 1

2

df = n1 + n2 - 2

Jumlah titik 1 17 Jumlah titik 2 18

SD1 85,2154

SD2 378,5580

SD1² 7261,6644

SD2² 143306,1594

S² 77345,1921

S 278,1100

slope1 2283,4829 slope2 2484,6339

√1/n1 +1/n2 0,3382

df 33

t hitung -2,14 t table 2,03

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul Validasi Metode Analisis para-phenylenediamine (PPD) Dalam Formulasi Pewarna Rambut Oksidatif memiliki nama lengkap Cynthia Feliana. Penulis dilahirkan di Yogyakarta pada tanggal 16 Februari 1993 sebagai anak kedua dari dua bersaudara, dari pasangan Ali Subagyo dan Lucia Sri Christiani. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis yaitu di TK Pangudi Luhur Yogyakarta (1997-1999), SD Pangudi Luhur I Yogyakarta (1999-2005), SMP Stella Duce I Yogyaka rta (2005-2008), SMA Stella Duce I Yogyakarta (2008-2011). Penulis melanjutkan pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tahun 2011. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi, antara lain Komunitas Mahasiswa Buddhis dan Kong Hu Cu (KMBK) Dharma Virya sebagai staf divisi hubungan masyarakat periode 2011-2012 dan sebagai ketua umum pada periode 2012-2013, Seminar Motivasi Andrie Wongso “Who Are You, Give or Be Given?” sebagai koordinator divisi dana dan usaha. Di bidang non akademik penulis pernah mengikuti perlombaan fotografi dalam acara Journalistic Competition tahun 2011 dan perlombaan bola basket dalam acara Pharmacy Performance and Event Cup pada tahun 2012. Di bidang akademik, penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia Dasar (2012), Analisis Farmasi (2013), Validasi Metode Analisis (2013), Farmakognosi Fitokimia (2013), Kimia analisis (2013) dan Pharmaceutical Analysis (2014).