Pereaksi Natrium Hidroksida 2 N Pereaksi Asam Sulfat 2 N Pereaksi Liebermann-Bouchard Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Nipah Analisis Data

29

g. Pereaksi Asam Klorida 2 N

Sebanyak 7,293 g asam klorida pekat diencerkan dengan air suling sampai 100 ml Depkes RI., 1995.

h. Pereaksi Natrium Hidroksida 2 N

Sebanyak 8,002 g pellet natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Depkes RI., 1995.

i. Pereaksi Asam Sulfat 2 N

Larutan asam sulfat pekat sebanyak 9,8 ml diatambahkan air suling sampai 100 ml Depkes RI., 1995.

j. Pereaksi Liebermann-Bouchard

Campur secara perlahan 5 bagian volume asam sulfat P dengan 50 bagian volume etanol 95 P. Tambahkan hati-hati 5 bagian volume asam asetat anhidrid ke dalam campuran tersebut, dinginkan Depkes RI., 2010.

k. Larutan Kloralhidrat

Sebanyak 50 g kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Depkes RI., 2010.

3.5.2 Pemeriksaan Alkaloid

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan lalu disaring Depkes RI., 1995. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan Mayer akan terbentuk endapan bewarna putih atau kuning 30 b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan Bouchardat akan terbentuk endapan bewarna coklat hitam c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan Dragendorff akan terbentuk endapan bewarna merah atau jingga. Alkaloida dinyatakan positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua atau tiga dari percobaan diatas.

3.5.3 Pemeriksaan Flavonoid

Sebanyak 10 g serbuk simplisia dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.

3.5.4 Pemeriksaan Glikosida

Simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 bagian volume 96 dan 3 bagian volume air suling, selanjutnya ditambahkan 10 ml HCl 2 N, direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Pada 30 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan ditambahkan natrium sulfat anhidrat, kemudian disaring, lalu filtratnya diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 o C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan dimasukan dalam tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas 31 air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch, kemudian secara perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya ikatan gula Reaksi Molish Depkes RI., 1995.

3.5.5 Pemeriksaan Tannin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai hampir tidak berwarna. Diambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida 1 . Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tannin Farnsworth, 1966.

3.5.6 Pemeriksaan Saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik, timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1- 10 cm. Ditambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2 N, bila buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin Depkes RI., 1995.

3.5.7 Pemeriksaan SteroidTriterpenoid

Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa dalam cawan penguap ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi hijau biru menunjukkan adanya steroida-triterpenoida Harborne, 1987. 32

3.6 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Nipah

Serbuk simplisia diekstraksi dengan cara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 70. Menurut Farmakope Indonesia edisi III, 1979 caranya adalah sebagai berikut : Sebanyak 10 bagian 200 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam sebuah bejana, dituangi dengan 75 bagian 1,5 L cairan penyari etanol 70, ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, kemudian diserkai, diperas. Ampas diremaserasi dengan cairan penyari etanol 70 secukupnya hingga diperoleh 2 L 100 bagian. Pindahkan ke bejana tertutup, dibiarkan ditempat sejuk, terlindung dari cahaya selama 2 hari. Enap tuangkan atau saring. Pemekatan ekstrak dilakukan dengan alat rotary evaporator pada suhu 40 C, selanjutnya diuapkan di waterbath pada suhu 40 C sampai diperoleh ekstrak kental 18,36 g. Nilai rendemennya sebesar 9,18.

3.7 Pembuatan Larutan dan Suspensi Pengujian Efek Antihiperglikemia

Pembuatan Larutan mencakup larutan aloksan, suspensi CMC 0,5, suspensi Metformin 65 mgkg bb, suspensi EEDN dosis 100, 200, dan 300 mgkg bb.

3.7.1 Pembuatan Larutan Aloksan

Aloksan monohidrat ditimbang sebanyak 175 mg, dilarutkan dalam larutan NaCl 0,9 dalam labu tentukur 10 ml. Larutan selalu dibuat baru setiap pengujian

3.7.2 Pembuatan Suspensi CMC 0,5

Sebanyak 0,5 g CMC ditaburkan dalam lumpang yang berisi ± 10 ml air suling panas 20 bagian. Didiamkan selama 15 menit lalu digerus hingga 33 diperoleh massa yang transparan, lalu digerus sampai homogen, diencerkan dengan air suling, dihomogenkan dan dimasukkan ke labu tentukur 100 ml, dicukupkan volumenya dengan air suling hingga garis tanda.

3.7.3 Pembuatan Suspensi Metformin Dosis 65 mgkg bb

Dosis metformin untuk manusia adalah 500 mg, maka dosis untuk mencit berat 20 g dikonversikan 0,0026 maka, 0,0026 x 500 mg = 1,3 mg. Dosis per kg berat badan adalah = 201000 x 13 mg = 65 mgkg bb. Timbang serbuk tablet metformin setara dengan 65 mg, dimasukkan ke dalam lumpang lalu ditambahkan suspensi CMC 0,5 bv sedikit demi sedikit sambil digerus sampai homogen, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml dicukupkan dengan suspensi CMC 0,5 sampai garis tanda lampiran 13 halaman 69. 3.7.4 Pembuatan Suspensi EEDN Dalam pengujian digunakan 3 variasi dosis yakni dosis 100, 200, dan 300 mgkg bb, sejumlah 100, 200, dan 300 mg EEDN dimasukkan ke dalam lumpang dan ditambahkan suspensi CMC 0,5 bv sedikit demi sedikit sambil digerus sampai homogen, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml dicukupkan dengan suspensi CMC 0,5 sampai garis tanda.

3.8 Pengujian Efek Antihiperglikemia EEDN

Pengujian efek antihiperglikemia EEDN terdiri dari penggunaan alat bloodglucose test meter GlucoDr ® , pengukuran kadar glukosa darah, uji pendahuluan dan orientasi dosis dengan metode tes toleransi glukosa oral, pengujian efek antihiperglikemia EEDN dengan metode induksi aloksan. 34

3.8.1 Penggunaan blood gluco test meter GlucoDr

® Kadar glukosa darah diukur dengan alat glukometer menggunakan tes strip yang bekerja secara enzimatis, yaitu sampel darah akan masuk ke dalam test strip melalui aksi kapiler. Glukosa yang ada dalam darah akan bereaksi dengan glukosa oksidase dan kalium ferisianida yang ada dalam strip dan menghasilkan kalium ferosianida. Kalium ferosianida yang dihasilkan sebanding dengan konsentrasi glukosa yang ada dalam sampel darah. Oksidasi kalium ferosianida akan menghasilkan muatan listrik yang akan diubah oleh glukometer untuk ditampilkan sebagai konsentrasi glukosa pada layar. Alat yang digunakan untuk mengukur kadar glukosa darah adalah GlucoDr ® . Glukometer ini secara otomatis akan hidup ketika test strip dimasukkan dan akan mati setelah beberapa menit test strip dicabut. GlucoDr ® check strip dimasukkan ke alat GlucoDr ® sehingga glukometer ini akan hidup secara otomatis, kemudian dicocokkan kode nomor yang muncul pada layar dengan yang ada pada vial GlucoDr ® test strip. Test strip yang dimasukkan pada glukometer pada bagian layar akan tertera angka yang sesuai dengan kode vial GlucoDr ® test strip, kemudian pada layar monitor glukometer muncul tanda siap untuk diteteskan darah. Caranya dengan menyentuh 1 tetes darah yang keluar ke tes strip dan ditarik sendirinya melalui aksi kapiler. Ketika wadah terisi penuh oleh darah, alat mulai mengukur kadar glukosa darah. Hasil pengukuran diperoleh selama 10 detik.

3.8.2 Pengukuran Kadar Glukosa Darah KGD

Kadar glukosa darah mencit yang dipuasakan tidak diberi makan tetapi tetap diberi minum selama 18 jam sebelum percobaan diukur menggunakan glukometer. Masing-masing mencit diukur dengan diambil darah mencit melalui 35 pembuluh darah vena, setelah ekor mencit didesinfektan dengan etanol 70, ujung ekor digunting secara aseptik, tetesan darah pertama dibuang, tetesan berikutnya diserapkan pada test strip yang terselip pada alat. Sejumlah darah tertentu akan terserap sesuai denga kapasitas serap test strip, setelah itu pendarahan ekor mencit dihentikan, dalam waktu 10 detik pada layar tertera kadar glukosa darah dalam satuan mgdl.

3.8.3 Uji Pendahuluan dan Orientasi Dosis

Uji pendahuluan dan orientasi dosis dilakukan dengan metode tes toleransi glukosa oral TTGO yaitu pemberian glukosa 50 dengan dosis 3 gkg bb. Mencit sehat yang sudah diaklimatisasi, dipuasakan selama 18 jam kemudian ditimbang berat badan dan diukur KGD puasa. Mencit dibagi menjadi 8 kelompok, yaitu: Kelompok I : suspensi CMC 0,5 bv Kelompok II : suspensi EEDN dosis 100 mgkg bb Kelompok III : suspensi EEDN dosis 150 mgkg bb Kelompok IV : suspensi EEDN dosis 200 mgkg bb Kelompok V : suspensi EEDN dosis 250 mgkg bb Kelompok VI : suspensi EEDN dosis 300 mgkg bb Kelompok VII : suspensi EEDN dosis 400 mgkg bb Kelompok VIII : suspensi Metformin Dosis 65 mgkg bb Tiga puluh menit kemudian masing-masing kelompok diberi glukosa 50 dosis 3 gkg bb sebagai loading dose, lalu pada menit 30, 60, 90, dan 120 diukur KGD. 36

3.8.4 Pengujian Efek Antihiperglikemia EEDNMetode Induksi Aloksan

Mencit jantan sebanyak 25 ekor dengan berat badan 20-35 g yang telah dipuasakan ditimbang berat badannya, ditentukan kadar glukosa darah puasa, kemudian masing-masing mencit diinduksi dengan aloksan dosis 175 mgkg bb secara intraperitoneal. Mencit diberi makan dan minum seperti biasa, diamati tingkah laku dan bobot badan, mencit dianggap diabetes apabila kadar glukosa darah puasa ≥ 200 mgdl Hayati, dkk., 2010, dan telah dapat digunakan untuk pengujian. Mencit diabetes dikelompokkan secara acak menjadi 5 kelompok, masing- masing terdiri dari 5 ekor dan diberi perlakuan secara oral, yakni : Kelompok I : suspensi CMC 0,5 bv Kelompok II : suspensi EEDN dosis 100 mgkg bb Kelompok III : suspensi EEDN dosis 200 mgkg bb Kelompok IV : suspensi EEDN dosis 300 mgkg bb Kelompok V : suspensi Metformin dosis 65 mgkg bb Kelima kelompok diberi sediaan uji selama 2 minggu berturut-turut, pengukuran kadar glukosa darah diukur pada hari ke-0, 3, 6, 9, 12 dan ke-15 menggunakan alat ukur glukometer. Selanjutnya dihitung persen penurunan KGD dengan rumus: Keterangan: a = KGD setelah diinduksi aloksan b = KGD pada waktu pengamatan hari ke-t Penurunan KGD = �−� � �100 37

3.9 Analisis Data

Data hasil penelitian dianalisis dengan metode analisis variansi ANAVA dengan tingkat kepercayaan 95 dan dilanjutkan dengan uji rata-rata Tukey untuk melihat perbedaan nyata antar perlakuan. Analisis statistik ini menggunakan program SPSS versi 18. 38

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Karakteristik Daun Nipah

Hasil identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense pusat penelitian biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Cibinong menyebutkan bahwa tumbuhan yang digunakan adalah tumbuhan nipah Nypa fruticans Wurmb. famili arecaceae. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 53. Hasil makroskopik daun nipah segar adalah berwarna kuning muda, rasa kelat, berbentuk pita memanjang dan meruncing bagian ujung, memiliki tulang daun yang disebut lidi seperti pada daun kelapa, panjang daun bisa mencapai 100 cm dan lebar daun 4-7 cm. Gambar dapat dilihat pada lampiran 3 halaman 55. Hasil pemeriksaan karakterisasi serbuk simplisia daun nipah dapat dilihat pada Tabel 4.1. Tabel 4.1 hasil karakterisasi serbuk simplisia daun nipah No Karakterisasi serbuk simplisia Simplisia Kadar Persy. MMI 1 Kadar air 7,91 Tidak tercantum 2 Kadar sari larut dalam air 16,48 Tidak tercantum 3 Kadar sari larut dalam etanol 13,28 Tidak tercantum 4 Kadar abu total 5,77 Tidak tercantum 5 Kadar abu tidak larut dalam asam 2,83 Tidak tercantum Hasil karakterisasi serbuk simplisia menunjukkan bahwa kadar air simplisia adalah 7,91, jika kadar air lebih dari 10 dapat terjadi proses pembusukan dan merusak bahan, sehingga tidak dapat disimpan dalam jangka