Alat Pembuatan Ekstrak METODE PENELITIAN

24

BAB III METODE PENELITIAN

Metode yang digunakan adalah metode deskriptif meliputi pengumpulan dan pengolahan sponge, pemeriksaan karakteristik, uji pendahuluan golongan senyawa, pembuatan ekstrak etanol, isolasi senyawa alkaloida dengan metode pengocokan asam basa, analisis senyawa alkaloida secara kromatografi lapis tipis KLT, isolasi senyawa alkaloida secara KLT preparatif, uji kemurnian isolat secara KLT dua arah serta identifikasi isolat secara spektrofotometri ultraviolet UV dan spektrofotometri inframerah IR. Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Medan.

3.1 Alat

Alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas laboratorium, blender Panasonic, eksikator, hair dryer Panasonic, kaca objek, kaca penutup, lemari pengering, mikroskop Olympus, neraca analitik Vibra AJ, oven listrik Stork, penangas air Yenaco, seperangkat alat destilasi, seperangkat alat kromatografi lapis tipis, seperangkat alat penetapan kadar air, spektrofotometer UV Shimadzu, spektrofometer IR IR-Prestige 21 dan tanur Nabertherm. 3.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sponge jenis Xestospongia sp de Laubenfels. Bahan-bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas proanalisis yaitu amonia, asam asetat glasial, asam klorida, asam Universitas Sumatera Utara 25 sulfat, bismuth III nitrat, diklorometana, etanol destilasi, iodium, kalium bromida, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, raksa II klorida, toluen dan air suling. 3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Sponge 3.3.1 Pengumpulan sponge Pengumpulan sponge dilakukan dengan cara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan hewan serupa dari daerah lain. Sponge yang digunakan adalah sponge jenis Xestospongia sp de Laubenfels dari Pantai Labuhan Angin, Sibolga, Tapanuli Tengah.

3.3.2 Identifikasi sponge

Identifikasi sponge dilakukan di Laboratorium Ekologi Prodi Biologi FMIPA Institut Teknologi Sepuluh Nopember ITS Surabaya adalah jenis Xestospongia sp de Laubenfels, suku Petrosiidae. Hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 47.

3.3.3 Pengolahan sponge

Sponge yang telah dikumpulkan, disortasi basah yaitu memisahkan sponge dari pengotornya, kemudian sponge yang telah terkumpul dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan pengotor yang masih melekat, ditiriskan dan ditimbang berat sponge Xestospongia sp de Laubenfels adalah 2130 g. Sponge dipotong dengan ukuran 2 cm x 2 cm, kemudian dimasukkan ke dalam lemari pengering pada suhu 40 – 50 o C selama 6 hari. Berat simplisia sponge Xestospongia sp de Laubenfels adalah 410 g. Simplisia selanjutnya diserbuk dengan menggunakan blender. Serbuk simplisia disimpan dalam kantung plastik untuk mencegah pengotor lainnya selama penyimpanan. Universitas Sumatera Utara 26 3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.4.1 Larutan pereaksi asam klorida 2 N Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga diperoleh larutan 200 ml Ditjen POM, 1995.

3.4.2 Larutan pereaksi Bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 20 ml air suling, ditambahkan iodium sebanyak 2 g dan diencerkan dengan air suling hingga volume larutan 100 ml Ditjen POM, 1995.

3.4.3 Larutan pereaksi Dragendorff

Sebanyak 0,8 g bismuth III nitrat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat. Sebanyak 27,2 g kalium iodida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 50 ml air suling pada wadah lain. Kedua larutan dicampurkan dan didiamkan hingga memisah sempurna. Lapisan jernih diambil dan diencerkan dengan air suling hingga volume larutan 100 ml Ditjen POM, 1995.

3.4.4 Larutan pereaksi Mayer

Sebanyak 1,4 g raksa II klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 60 ml air suling dan sebanyak 5 g kalium iodida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan dengan air suling hingga volume larutan 100 ml Ditjen POM, 1995.

3.4.5 Larutan pereaksi Liebermann-Burchard

Sebanyak 5 bagian volume asam sulfat pekat dicampurkan dengan 50 bagian volume etanol 96, kemudian ditambahkan dengan hati-hati 5 bagian volume asam asetat anhidrida dalam campuran tersebut dan didinginkan Ditjen POM, 1995. Universitas Sumatera Utara 27

3.4.6 Larutan air-kloroform

Sebanyak 2,5 ml kloroform dicampur dengan air suling secukupnya hingga diperoleh larutan 1000 ml Ditjen POM, 1995.

3.4.7 Larutan kloralhidrat

Sebanyak 50 g kloralhidrat ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml air suling Ditjen POM, 1995. 3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam. Hasil perhitungan kadar karakteristik simplisia dapat dilihat pada Lampiran 11, halaman 62 – 66.

3.5.1 Pemeriksaan makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, ukuran, ketebalan, konsistensi dan warna. Gambar makroskopik sponge dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 48 – 50.

3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia dengan cara menaburkan serbuk simplisia di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan kloralhidrat dan ditutupi dengan kaca penutup, kemudian dilihat di mikroskop. Gambar mikroskopik serbuk simplisia sponge dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 51. Universitas Sumatera Utara 28

3.5.3 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen WHO, 1998. Cara kerja : 1. Penjenuhan toluen Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, didestilasi selama 2 jam. Toluen didinginkan selama 30 menit dan volume air pada tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. 2. Penetapan kadar air simplisia Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan ke dalam labu yang berisi toluen tersebut, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit hingga toluen mendidih. Kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetesan perdetik hingga sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan hingga 4 tetes perdetik. Bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen setelah semua air terdestilasi. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan dingin sampai suhu kamar. Volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml setelah air dan toluen memisah sempurna. Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa.

3.5.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform dalam labu bersumbat sambil dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan penguap berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 C hingga bobot tetap. Kadar sari larut dalam air Universitas Sumatera Utara 29 dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan Ditjen POM, 1995.

3.5.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Filtrat disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol 96. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan penguap berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 C hingga bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan Ditjen POM, 1995.

3.5.6 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2 g serbuk ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam cawan porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan- lahan hingga arang habis. Pemijaran dilakukan pada suhu 500 – 600C selama 3 jam, kemudian didinginkan dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1998.

3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut asam

Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu dan dipijarkan hingga bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1998. Universitas Sumatera Utara 30

3.6 Uji Pendahuluan Golongan Senyawa

Uji pendahuluan golongan senyawa terhadap serbuk simplisia meliputi pemeriksaan golongan senyawa alkaloida, saponin dan steroidatriterpenoida.

3.6.1 Pemeriksaan alkaloida

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, kemudian ditambah 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan berwarna putih atau kuning. b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam. c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff akan terbentuk endapan warna merah atau jingga Ditjen POM, 1995. Alkaloida disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua atau tiga dari percobaan di atas Ditjen POM, 1995.

3.6.2 Pemeriksaan saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat selama 10 detik. Busa yang terbentuk setinggi 1 – 10 cm, stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Ditjen POM, 1995.

3.6.3 Pemeriksaan steroidatriterpenoida

Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksana selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrida dan Universitas Sumatera Utara 31 diuapkan. Sisanya ditambahkan 2 tetes asam sulfat pekat. Timbulnya warna ungu atau merah yang kemudian berubah menjadi hijau biru menunjukkan adanya steroidatriterpenoida Harborne, 1987.

3.7 Pembuatan Ekstrak

Pembuatan ekstrak dilakukan secara perkolasi menggunakan cairan penyari etanol. Cara kerja : Sebanyak 350 g serbuk simplisia sponge dimasukkan ke dalam bejana tertutup, kemudian direndam dengan cairan penyari etanol selama 3 jam. Massa dimasukkan ke dalam perkolator, cairan penyari etanol dituang secukupnya sampai terdapat selapis cairan penyari di atas serbuk simplisia, kemudian mulut perkolator ditutup dengan aluminium foil dan plastik dan dibiarkan selama 24 jam. Kran perkolator dibuka setelah 24 jam, cairan perkolat dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 tetes per detik dan ditampung ke dalam botol berwarna bening. Perkolasi dihentikan apabila sebanyak 500 mg cairan perkolat terakhir diuapkan di atas penangas air tidak meninggalkan sisa. Perkolat dipekatkan dengan bantuan alat penguap rotary evaporator pada suhu tidak lebih dari 40 C sampai diperoleh ekstrak kental Ditjen POM, 1979. Bagan pembuatan ekstrak etanol dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 53.

3.8 Isolasi Senyawa Alkaloida Ekstrak Etanol dengan Metode Asam Basa