20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODELOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dimulai Mei-Desemeber 2012. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kimia dan Mikrobiologi Gedung Produk Makanan dan Kesehatan
Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan Radiasi PATIR Badan Tenaga Nuklir Nasional BATAN
Pasar Jum’at Jakarta Selatan dan Laborotorium Pharmacy Medicinal Chemistry PMC FKIK UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta.
3.2 Alat Penelitian
Alat yang digunakan meliputi Iradiator Karet Alam IRKA, inkubator Haereus, laminar air flow Envair, vakum rotari evaporator Hahnvapor, oven
listrik Hareus, mikroskop elektrik Nikon Labophot dan Nikon HF X-DX, timbangan analitik Sartorius, hot plate Quebec, erlenmeyer 50 mL, 250 mL
dan 500 mL, cawan petri diameter 9 mm dan 15 mm, cawan porselin, tabung reaksi 10 mL dan 20 mL, botol kaca, batang pengaduk, silinder stainless steel
6,0 mm, spatel logam, jarum ose, pinset, mikropipet eppendorf socorex, pipet volume 1 mL, 2 mL, 5 mL dan 25 mL, lampu spiritus dan alumunium foil.
3.3 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada proses ekstraksi rimpang temu putih dan buah mahkota dewa meliputi asam alkohol, amonia encer, kloroform, pereaksi mayer,
pereaksi Draggendroff, etil asetat, besi III klorida, asam sulfat pekat, aquadestilata, etanol 96, minyak zaitun, kristal violet, larutan lugol dan safranin.
Bahan yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri meliputi bakteri Bacillus subtilis, Staphylococcus aereus, NA Nutrient Agar, TSA Triyptic Soy
Agar, TSB Tryptic Soy Broth, antibiotik kanamisin dan etanol 10.
21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Pengambilan Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini yakni rimpang temu putih yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat dan Rempah dan mahkota
dewa yang diambil dari kebun yang dibudidayakan oleh BATAN.
3.4.2 Determinasi Bahan Uji
Bahan uji dideterminasi di Herbarium Bogoriense Balitbang Botani Puslitbang LIPI Cibinong.
3.4.3 Ekstraksi
Pembuatan serbuk dari sampel segar dilakukan di Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat Balittro. Sebanyak masing-masing 1300 g serbuk
rimpang temu putih dan 1000 g serbuk buah mahkota dewa ditimbang dan di tempatkan dalam wadah. Masing-masing serbuk kemudian dimaserasi
menggunakan etanol 96 sebanyak 1:4 bv serbuk rimpang temu putih 5,2 L dan serbuk buah mahkota dewa 4 L, lalu didiamkan selama sekurangnya 24 jam
sambil sesekali diaduk. Maserat disaring kemudian diuapkan pada tekanan rendah dengan menggunakan vakum rotari evaporator pada suhu 50
o
C sehingga diperoleh ekstrak kental. Proses maserasi ini dilakukan berulang remaserasi sebanyak 3
kali terhadap temu putih dan sebanyak 4 kali terhadap mahkota dewa hingga diperoleh maserat yang sudah tidak berwarna.
Masing-masing ekstrak dimasukkan ke dalam wadah gelas steril, dimana masing-masing ekstrak dibagi menjadi 2 tempat yaitu untuk ekstrak non iradiasi
dan ekstrak hasil iradiasi. Ekstrak diiradiasi dengan dosis 10 kGy dengan laju
dosis 7 kGyjam selama 80 menit, di Iradiator Karet Alam IRKA, Badan Tenaga
Nuklir Nasional BATAN, Pasar Jumat, Jakarta Selatan.
3.4.4 Standardisasi Ekstrak
Beberapa standardisasi bahan uji dilakukan sesuai dengan standar yang ditetapkan dalam Meteria Medika Edisi V 1989, sebagai berikut:
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
1. Penetapan Kadar Abu
Ekstrak etanol rimpang temu putih dan mahkota dewa, masing-masing ditimbang sebanyak 2 g terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara dan
dimasukan ke dalam cawan porselin yang telah dipijarkan dan ditara kemudian diratakan. Ekstrak perlahan-lahan dipijarkan hingga suhu 675
o
C sampai arang habis. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan,
ditambahkan air panas, disaring melalui kertas saring bebas abu. Residu dan kertas saring dipijarkan dalam cawan yang sama pada suhu 675
o
C hingga abu berwarna putih atau hampir putih. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang
telah dikeringkan di udara.
2. Penetapan Kadar Abu yang tidak larut dalam Asam
Abu yang diperoleh dari penetapan kadar abu, dididihkan dengan 25 mL asam klorida 3N selama 5 menit, bagian yang tidak larut asam dikumpulkan,
disaring menggunakan kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas, dipijarkan hingga bobot tetap dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut asam
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
3. Penetapan Kadar Sari yang larut dalam air
Ekstrak etanol rimpang temu putih dan buah mahkota dewa masing-masing ditimbang sebanyak 5,0 g dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan dimaserasi
selama 24 jam dengan 100 mL campuran air-kloroform 2,5 mL kloroform dalam 1L air sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama dan didiamkan
selama 18 jam. Sebanyak 20 mL filtrat yang telah disaring, diuapkan hingga kering di dalam cawan penguap yang telah ditara, sisa dipanaskan pada suhu
105
o
C hingga bobot tetap dan dihitung kadarnya dalam persen sari yang larut dalam air tehadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
4. Pentapan Kadar Sari yang larut dalam etanol
Ekstrak etanol rimpang temu putih dan buah mahkota dewa masing-masing ditimbang sebanyak 5,0 g dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan dimaserasi
selama 24 jam dengan 100 mL etanol 95 sambil sesekali dikocok selama
23
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam. Sebanyak 20 mL filtrat disaring dengan cepat untuk menghindari penguapan etanol 95, diuapkan
hingga kering dalam cawan penguap yang telah ditara, sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C hingga bobot tetap dan dihitung kadarnya dalam persen sari yang larut dalam etanol 95 tehadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
5. Uji Susut Pengeringan
Sejumlah 2 g ekstrak etanol rimpang temu putih dan buah mahkota dewa masing-masing ditimbang seksama dalam wadah yang telah dipanaskan pada
suhu 105
o
C selama 30 menit dan telah ditara. Ekstrak diratakan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol, kemudian dimasukkan ke dalam
oven, dibuka tutupnya dan dikeringkan pada suhu 105
o
C hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, botol dibiarkan dalam keadaan tertutup
mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar. Kadar dihitung dalam persen dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara, dengan rumus:
3.4.5 Penapisan Fitokimia Ekstrak Gacche et al., 2011
1. Identifikasi Golongan Alkaloid
Sejumlah 0,5 g ekstrak masing-masing dilarutkan dalam 10 mL asam alkohol, dididihkan dan disaring. Ke dalam 5 mL filtrat ditambahkan 2 mL amonia
encer. Kemudian ditambahkan 5 mL kloroform dan diguncangkan dengan lembut untuk mengekstrak dasar alkaloid. Lapisan kloroform diekstraksi
dengan 10 mL asam asetat. Dibagi menjadi dua bagian. Reagen Mayer ditambahkan ke dalam satu bagian dan reagen Draggendorff untuk yang lain.
Pembentukan krim dengan reagen Mayer atau endapan coklat kemerahan dengan reagen Draggendorff dianggap sebagai positif adanya alkaloid.
2. Identifikasi Golongan Flavonoid
Sejumlah 0,5 g ekstrak dipanaskan dengan 10 mL etil asetat sampai mendidih selama 3 menit. Campuran disaring, kemudian 4 mL filtrat dikocok dengan
1mL larutan amonia encer. Terbentuknya warna kuning menunjukkan adanya flavonoid.
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3. Identifikasi Golongan Tanin
Sejumlah 0,5 g ekstrak dididihkan dalam 10 mL air kemudian disaring. Ditambahkan beberapa tetes ferri klorida 0,1 dan diamati. Terbentuknya
warna hijau kecoklatan atau biru-hitam menunjukkan adanya tanin.
4. Identifikasi Fenol
Sejumlah 0,5 g ekstrak ditambahkan 1-2 tetes FeCl
3
5 maka akan terbentuk peningkatan intensitas warna hijau sampai biru menunjukkan adanya fenolik.
5. Identifikasi Terpenoid
Sejumlah masing-masing 0,5 g ekstrak ditambahkan 2 mL kloroform, kemudian ditambahkan H
2
S0
4
pekat 3 mL dengan hati-hati untuk membentuk lapisan. Terbentuknya warna coklat kemerahan menunjukkan
adanya terpenoid.
6. Identifikasi Golongan Saponin
Sejumlah 0,5 g ekstrak ditambahkam 5 mL air suling dalam tabung reaksi. Larutan diguncangkan dan diamati terbentuknya buih gigih stabil. Buih
tersebut ditambahkan dengan 3 tetes minyak zaitun dan diguncangkan, kemudian diamati adanya pembentukan emulsi.
3.4.6 Uji Aktivitas Antibakteri
1. Sterilisasi alat dan bahan
Alat dan bahan yang akan digunakan dalam percobaan disterilkan menurut cara yang cocok untuk masing-masing alat dan bahan. Alat-alat seperti jarum
inokulasi, gelas objek, pinset disterilkan dengan api. Alat gelas seperti cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer yang sebelumnya telah dibungkus dengan
aluminium foil disterilkan di dalam oven pada suhu 170°C selama 30 menit. Sedangkan media perbenihan dan air suling disterilkan dalam autoklaf pada
suhu 121°C selama 15 menit Farmakope Indonesia Edisi IV. 1995.
2. Pembuatan Media Pembenihan Petunjuk Preparasi Produk
a. Nutrient Agar NA
Sebanyak 23 gram serbuk nutrient agar dilarutkan dalam 1 L aquadest dalam erlenmeyer. Kemudian mulut erlenmeyer disumbat dengan kapas
25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang dibalut kain kasa, lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 15 lbs selama 15 menit.
b. Tryptic Soy Broth TSB
Kategori