UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dipijarkan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 2000.
3.4.5. Persiapan Hewan Uji
Sebelum percobaan, disiapkan tempat pemeliharaan hewan uji meliputi kandang, sekam, tempat makan dan tempat minum tikus. Tikus
jantan diaklimatisasi di Laboratorium Animal House selama 14 hari agar dapat menyesuaikan diri dengan lingkungannya yang baru. Tikus diberi
makan dan minum standar ad libitum, dilakukan pengamatan kondisi umum tikus serta ditimbang berat badannya. Penimbangan dilakukan
untuk mengetahui pertambahan berat badan dari masing-masing kelompok. Setiap ekor tikus diberi tanda pengenal agar tidak salah dalam
perlakuan, selanjutnya dilakukan perlakuan sesuai dengan yang tertera dalam Tabel 3.1. rancangan perlakuan pada tiap kelompok tikus.
3.4.6. Pemberian Perlakuan
Penelitian ini menggunakan 25 ekor tikus albino jantan galur Sprague-Dawley yang diberikan 5 perlakuan berbeda. Masing-masing
perlakuan terdiri dari 5 ekor tikus putih jantan. Ekstak etanol 70 biji jarak pagar disuspensikan dalam pembawa Na CMC 1 dengan dosis
yang telah ditentukan yang diberikan secara oral. Pemberian ekstrak diberikan peroral satu hari sekali setiap pagi hari dan dilakukan selama 48
hari sesuai dengan siklus spermatogenesis Krinke, G.J. 2000.
3.4.7. Pengukuran Parameter
3.4.7.1.Pengukuran Konsentrasi Spermatozoa
Pengukuran konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan cara mengambil spermatozoa pada kauda epididimis. Bagian dari kauda
epididimis dipotong lalu dikeluarkan cairannya kemudian ditampung diwadah yang berisi NaCl Fisiologis 0,9 sebanyak 500 µL. Spermatozoa
dimasukkan kedalam bilik hitung Neubauer Hemasitometer sampai kamar Neubauer terisi rata, kemudian dihitung jumlah spermatozoa pada
salah satu kamar hitung Neubauer dan selanjutnya ditentukan pengenceran yang dilakukan dan jumlah kotak yang akan dihitung Tabel 3.2.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 3.2 Pengenceran yang dilakukan dan kotak yang dihitung
No. Jumlah Spermatozoa
dalam 1 kotak Pengenceran
Kotak yang dihitung
1. ≥ 40
50 kali 5
2. 15-40
20 kali 10
3. ≤ 15
10 kali 25
Berdasarkan jumlah spermatozoa yang diketahui, maka dilakukan pengenceran spermatozoa berdasarkan jumlah spermatozoa yang dihitung
Ilyas,S. 2007.
Tabel 3.3 Cara Pengenceran
No. Pengenceran Pembuatan Pengenceran
1. 50 kali
a. 980 µL Larutan George + 20 µL spermatozoa b. 2.450 µL Larutan George + 50 µL spermatozoa
2. 20 kali
950 µL Larutan George + 50 µL spermatozoa 3.
10 kali a. 900 µL Larutan George + 100 µL spermatozoa
b. 450 µL Larutan George + 50 µL spermatozoa
Keterangan: Poin a dan b menunjukkan opsi perlakuan pilih salah satu
Tahapan selanjutnya jika telah dilakukan pengenceran, dilakukan perhitungan spermatozoa dengan jumlah kotak yang dihitung sesuai
dengan jumlah spermatozoa dan cara pengenceran pada tabel diatas. Kemudian dilakukan pengukuran spermatozoa sesuai rumus dibawah ini
� = 10.000
� 25
�
Keterangan : n
: jumlah spermatozoa yang terhitung. 10.000 : volume kamar hitug Neubauer.
Fp : faktor pengenceran yang dilakukan
25 : total kotak kecil yang terdapat dalam kamar hitung Neubauer
k : jumlah kotak kecil yang dihitung saat pengamatan
v NaCl : volume NaCl mL fisiologis yang digunakan
Perhitungan konsentrasi spermatozoa JutamL dapat terlihat dari tabel berikut :
Tabel 3.4 Rumus Konsentrasi Spermatozoa
No. Jumlah kotak yang dihitung
Rumus konsentrasi spermatozoa 1.
5 n x 10.000 x 50 x 5 x 0,5
2. 10
n x 10.000 x 20 x 2,5 x 0,5 3.
25 n x 10.000 x 10 x 1 x 0,5
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.7.2.Aktivitas Spermisidal
Aktivitas spermisidal ditentukan untuk mengukur konsentrasi minimum zat spermisida yang dibutuhkan untuk membunuh 100
sperma dalam 20 detik. Bahan uji berbagai konsentrasi 0,25 mgmL; 0,5 mgmL; 0,75 mgmL; 1 mgmL; 1,5 mgmL; 2 mgmL; 2,5 mgmL; 3
mgmL; 3,5 mgmL dan 4 mgmL dicampur dengan suspensi sperma dengan perbandingan 1:1 AshishRanjan, Singth, 2013.
Campuran tersebut diamati di bawah mikroskop pada perbesaran 40x selama 20 detik lalu diamati motilitas spermanya. Dicatat persen
motilitasnya jika ada sperma motil terlihat. Dua ratus lima puluh mikroliter 250 µL
Baker’s buffer glukosa 3, Na
2
HPO
4
.2 H
2
O 0,31, NaCl 0,2, KH
2
PO
4
0,01 ditambahkan ke dalam campuran ekstrak dan suspensi sperma yang tidak terdapat sperma motil dan kemudian
diinkubasi pada suhu 37°C selama minimal 60 menit. Larutan tersebut dicampurkan perlahan-lahan dan diamati lagi untuk setiap sperma yang
motil. Konsentrasi ekstrak yang diuji dicatat sebagai konsentrasi efektif
jika kedua tes menunjukkan tidak adanya sperma motil. Konsentrasi minimum
dari ekstrak
biji jarak
pagar yang
menyebabkan imobilisasiperhentian semua sperma dalam 20 detik tanpa kebangkitan
motilitas dalam larutan buffer setelah 60 menit yang diinkubasi pada suhu 37
o
C dianggap sebagai minimum effective concentration MEC Kumbar, S.B., U.C. Jadaramkunti dan R.H. Aladakatti. 2012.
3.4.7.3.Konsentrasi Hormon Testosteron Serum
Selama 48 hari tikus diberikan perlakuan dengan cara memberikan ekstrak etanol 70 biji jarak pagar secara oral. Pada hari ke 0 dan 49
dilakukan pengambilan darah melalui ekor lateral tail vein sebanyak ±1 mL kemudian dimasukkan ke dalam tube. Darah dalam tube disentrifugasi
dengan kecepatan 3.000 rpm untuk memisahkan serum yang akan digunakan untuk mengukur kadar testosteron tikus. Serum tersebut
disimpan dalam freezer suhu -20
o
C sampai hari pengukuran Akmal, Muslim., Chanif Mahdi dan
Aulanni’am. 2010.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pengukuran kadar hormon testosteron serum dilakukan di laboratorium Multiguna dengan menggunakan kit ELISA Testosteron dari
DRG International. Kadar hormon minimal yang dapat terdeteksi pada kit ini adalah 0,083 ngmL. Prosedur pengukuran hormon dilakukan
berdasarkan instruksi manual yang disertakan dalam kit. Pertama-tama setiap 25 µL dari masing-masing standar, kontrol
dan sampel dimasukkan ke dalam sumuran pada plat. Dua ratusmikro liter Enzyme Conjugate dimasukkan ke dalam setiap sumuran dan campur
secara menyeluruh selama 10 detik. Plat diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruang tanpa menutup plat. Dengan cepat isi dalam sumuran
ditumpahkan kemudian masing-masing sumuran dicuci dengan Wash Solution 400 µL setiap sumuran, proses tersebut diulangi sebanyak tiga
kali, lalu plat dibenturkan pada kertas penyerap untuk menghilangkan sisa tetesan pada sumuran. Sebanyak 200 µL Substrate Solution ditambahkan
kedalam setiap sumuran lalu inkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Reaksi enzimatik dihentikan dengan menambahkan 100 µL Stop Solution
kedalam setiap sumuran. Absorban dari tiap sumuran ditentukan dengan menggunakan microtiter plate ELISA reader pada panjang gelombang 450
±10nm. Pembacaan sumuran sebaiknya dilakukan dalam 10 menit setelah penambahan Stop Solution.
3.5. Analisis Data
