Tempat dan Waktu Penelitian Analisis Data

37

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini berlangsung dalam waktu 5 bulan, terhitung dari bulan Januari 2014 sampai Juni 2014. Penelitian dilakukan di Laboratoritum Kimia Obat, Laboratorium Penelitian II, Laboratorium Research, Laboratorium Multiguna, Laboraturium Hewan Animal House Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Hewan Uji

Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus albino jantan galur Sprague Dawley yang sehat, fertil, berumur 10 minggu dengan berat 200 sampai 250 gram yang diperoleh dari Animal Facility and Modeling Provider IPB Institut Pertanian Bogor sebanyak 25 tikus.

3.2.2. Bahan Uji

Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji tanaman jarak pagar Jatropha curcas L yang diperoleh dari BALITTAS Badan Penelitian Tanaman Manis dan Serat Malang, Jawa Timur. Tanaman yang digunakan sebelumnya dideterminasi terlebih dahulu di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Bogor.

3.2.3. Bahan Kimia

Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol 70, Na CMC, pereaksi untuk penapisan fitokimia ammoniak 25 dan 10, etil asetat, HCl pekat 10 dan 1, pereaksi Dragendorff; pereaksi Mayer; Aquadest; lempeng magnesium, butanol eter, pereaksi Liebermann – Buchard, FeCl 3 1, NaOH 1 N, petroleum eter, kloroform. Penyiapan sperma normal saline water, larutan George, NaCl, larutan Eosin-Y 1, buffer Baker’s asam pikrat, formaldehid 4, asam asetat dan NaCl Fisiologis. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.2.4. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik AND GH-202, vacuum rotary evaporator EYELA, labu erlenmeyer, gelas ukur, batang pengaduk, spatula, kertas saring, kapas, corong gelas, tabung reaksi, pipet tetes, oven Memmert, tanur Thermo Scientific, alumunium foil, timbangan hewan Ohauss, kandang tikus beserta tempat makanan dan minum, sonde oral, wadah pembiusan, alat bedah minor, kaca objek dan cover glass, cawan penguap, mikropipet Eppendorf Reasearch plus, tube, centrifuge Eppendorf, vortex Wiggen houser, mikroskop cahaya Motic BA 310 dan Epson, Hemasitometer Improved Neubauer NESCO, Kit ELISA Biozatix dan ELISA reader Biotek.

3.3. Rancangan Penelitian

3.3.1. Hewan Uji

Penelitian ini bersifat eksperimental yang terdiri atas 5 kelompok perlakuan dengan masing-masing terdiri dari 5 ekor tikus jantan Rattus novergicus L. galur Sprague Dawley. Jumlah tikus yang digunakan pada setiap kelompok penelitian disesuaikan dengan Research Guidelines for Evaluating The Safety and Efficacy of Herbal Medicines WHO, 2000 yaitu untuk pengujian pada hewan pengerat masing-masing kelompok terdiri dari setidaknya lima ekor.

3.3.2. Dosis Perlakuan

Acuan dosis yang digunakan berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Widia Dwi Arini 2012 dengan dosis 5mgkgBB, 25 mgkgBB dan 50 mgkgBB. Untuk perhitungan dosis dapat dilihat pada lampiran 7. Pemberian ekstrak etanol biji jarak pagar dilakukan selama 48 hari sesuai dengan siklus spermatogenesis tikus. Perlakuan yang dilakukan terdiri dari : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 3.1 Perlakuan terhadap kelompok tikus Keterangan: [ ] T adalah konsentrasi testosteron serum [ ] Spermatozoa adalah konsentrasi spermatozoa

3.4. Kegiatan Penelitian

3.4.1. Penyiapan Simplisia

Biji jarak yang telah dikeringkan dengan kadar air 8,15 diperoleh dari BALITTAS Badan Penelitian Tanaman Manis dan Serat Malang, Jawa Timur. Sebanyak 2 kg biji jarak pagar yang telah kering kemudian dihaluskan menggunakan seed grinder di Balai Penelitian Obat dan Tanaman Balitro Bogor hingga menjadi serbuk. Serbuk simplisia yang dihasilkan sebanyak 1,78 kg. Serbuk simplisia kemudian disimpan dalam wadah yang kering, tertutup rapat dan terlindung dari cahaya.

3.4.2. Pembuatan Ekstrak

Pembuatan ekstrak biji jarak pagar menggunakan metode ekstraksi cara dingin yaitu dengan remaserasi . Serbuk simplisia di maserasi dengan pelarut etanol 70 dalam wadah gelap hingga terendam. Pergantian pelarut dilakukan setiap 2 sampai 3 hari sekali. Proses maserasi ini diulang hingga menghasilkan maserat yang berwarna pucat mendekati tak berwarna. Maserat yang telah didapat kemudian difiltrasi menggunakan Kelompok Pelakuan Lama per- lakuan Bagian yang digunakan Pengukuran I Kontrol negatif Diberi pembawa Na CMC 1 sebanyak 1 mL 48 hari - Ekor - Kauda epididimis [ ] T [ ] Spermatozoa II Kondisi untuk dosis rendah Diberi suspensi ekstrak biji jarak pagar Jatropha curcas dengan dosis rendah yaitu 5mgkgBB 48 hari - Ekor - Kauda epididimis [ ] T [ ] Spermatozoa III Kondisi untuk dosis sedang Diberi suspensi ekstrak biji jarak pagar Jatropha curcas dengan dosis sedang yaitu 25mgkgBB 48 hari - Ekor - Kauda epididimis [ ] T [ ] Spermatozoa IV Kondisi untuk dosis tinggi Diberi suspensi ekstrak biji jarak pagar Jatropha curcas dengan dosis tinggi yaitu 50 mgkgBB 48 hari - Ekor - Kauda epididimis [ ] T [ ] Spermatozoa V Kelompok pegujian aktivitas spermisidal tidak diberi perlakuan - Kauda epididimis Aktivitas spermisidal UIN Syarif Hidayatullah Jakarta kapas dan kertas saring hingga didapatkan filtrat. Selanjutnya filtrat dipekatkan menggunakan vacuum rotary evaporator dan freeze dry sampai diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental yang dihasilkan selanjutnya disimpan di dalam lemari es.

3.4.3. Penapisan Fitokimia

Pada penapisan fitokimia dilakukan pemeriksaan terhadap kandungan golongan senyawa kimia dari ekstrak etanol 70 biji jarak pagar, meliputi pemeriksaan alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, steroid, dan terpenoid. 1. Identifikasi Golongan Alkaloid Sejumlah 0,5 gram ekstrak dimasukan ke dalam tabung reaksi kemudian tambahkan 2mL etanol 70 lalu aduk sampai rata. Tambahkan 5 mL asam klorida 2 N, dipanaskan di penangas air selama 2 menit, dan didinginkan. Kemudian disaring dan ditampung filtratnya. Filtrat ditambahkan beberapa tetes reagen Mayer. Sampel kemudian diamati hingga keruh atau ada terbentuk endapan Mojab, Kamalinejad, Ghaderi Vahidipour, 2003. 2. Identifikasi Golongan Flavonoid Sejumlah 0,5 gram ekstrak dimasukan ke dalam tabung reaksi kemudian tambahkan 2mL etanol 70 lalu aduk sampai rata. Tambahkan serbuk magnesium 0,5 gram dan 3 tetes HCl pekat. Terbentuknya warna jingga sampai merah menunjukkan adanya flavon, merah sampai merah padam menunjukkan flavanon, merah padam sampai merah keunguan menunjukkan flavanon Mojab, Kamalinejad, Ghaderi Vahidipour, 2003. 3. Identifikasi Golongan Saponin Sejumlah 0,5 gram ekstrak dimasukan ke dalam tabung reaksi kemudian tambahkan 2mL etanol 70 lalu aduk sampai rata. Tambahkan 20mL aquabides dan dikocok kemudian didiamkan selama 15-20menit. Jika tidak ada busa = negatif; busa lebih dari 1cm = positif lemah; busa dengan tinggi 1,2cm = positif kuat dan busa lebih besar UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dari 2cm = positif kuat Mojab, Kamalinejad, Ghaderi Vahidipour, 2003. 4. Identifikasi Golongan Tanin Sejumlah 0,5 gram ekstrak dimasukan ke dalam tabung reaksi kemudian tambahkan 2mL etanol 70 lalu aduk sampai rata. Kemudian masukkan ke dalam plat tetes lalu tambahkan FeCl 3 sebanyak 3 tetes, jika menghasilkan biru karakteristik, biru-hitam, hijau atau biru-hijau dan endapan Mojab, Kamalinejad, Ghaderi Vahidipour, 2003; Sarma Babu, 2011. 5. Identifikasi Golongan Steroid Sejumlah 0,5 gram ekstrak dimasukan ke dalam tabung reaksi kemudian tambahkan 2mL etanol 70 lalu aduk sampai rata. Tambahkan 2mL kloroform, kemudian ditambahkan 2 mL asam sulfat pekat dengan cara diteteskan perlahan dari sisi dinding tabung reaksi. Pembentukan cincin warna merah menunjukkan adanya steroid Mojab, Kamalinejad, Ghaderi Vahidipour, 2003. 6. Identifikasi Golongan Terpenoid Sejumlah 0,5 gram ekstrak dimasukan ke dalam tabung reaksi kemudian tambahkan 2mL etanol 70 lalu aduk sampai rata. Tambahkan 2mL kloroform dan 1mL asetat anhidrida lalu dinginkan. Setelah dingin tambahkan asam sulfat pekat. Jika terjadi warna kemerahan menunjukkan adanya terpenoid Mojab, Kamalinejad, Ghaderi Vahidipour, 2003.

3.4.4. Pengujian Parameter Spesifik dan Non Spesifik

3.4.4.1.Parameter Spesifik Parameter spesifik yang diamati meliputi : 1. Identitas Ekstrak. Deskripsi tata nama meliputi : - Nama ekstrak generik, dagang, paten - Nama latin tumbuhan sistematika botani - Bagian tumbuhan yang digunakan - Nama Indonesia tumbuhan Depkes RI, 2000 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2. Organoleptik. Penggunaan panca indera mendeskripsikan bentuk, warna, bau, rasa sebagai berikut : - Bentuk : padat, serbuk-kering, kental, cair - Warna : kuning, coklat, dll - Bau : aromatik, tidak berbau, dll - Rasa : pahit, manis, kelat, dll Depkes RI, 2000. 3.4.4.2.Parameter Non Spesifik 1. Susut Pengeringan Ekstrak ditimbang secara seksama sabanyak 1 g sampai 2 g dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105 C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang, ekstrak ditarakan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5mm sampai 10mm. Jika ekstrak diuji berupa ektrak kental, ratakan dengan batang pengaduk, kemudian dimasukkan ke dalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105 C hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam desikator hingga suhu kamar. Jika ekstrak sulit kering dan mencair pada pemanasan, ditambahkan 1g silika pengering yang telah ditimbang secara seksama setelah dikeringkan dan disimpan dalam desikator pada suhu kamar. Silika tersebut dicampur secara merata dengan ekstrak pada saat panas, kemudian keringkan kembali pada suhu penetapan hingga bobot tetap Depkes RI, 2000. 2. Kadar Abu Lebih kurang 2g sampai 3g ekstrak yang telah digerus dan ditimbang secara seksama dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, ratakan. Perlahan dipijarkan hingga arang habis, dinginkan, timbang. Jika cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas, saring melalui kertas saring bebas abu. Sisa kertas dan kertas saring dalam krus lalu dipijarkan. Filtrat dimasukkan ke dalam krus, diuapkan dan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dipijarkan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 2000.

3.4.5. Persiapan Hewan Uji

Sebelum percobaan, disiapkan tempat pemeliharaan hewan uji meliputi kandang, sekam, tempat makan dan tempat minum tikus. Tikus jantan diaklimatisasi di Laboratorium Animal House selama 14 hari agar dapat menyesuaikan diri dengan lingkungannya yang baru. Tikus diberi makan dan minum standar ad libitum, dilakukan pengamatan kondisi umum tikus serta ditimbang berat badannya. Penimbangan dilakukan untuk mengetahui pertambahan berat badan dari masing-masing kelompok. Setiap ekor tikus diberi tanda pengenal agar tidak salah dalam perlakuan, selanjutnya dilakukan perlakuan sesuai dengan yang tertera dalam Tabel 3.1. rancangan perlakuan pada tiap kelompok tikus.

3.4.6. Pemberian Perlakuan

Penelitian ini menggunakan 25 ekor tikus albino jantan galur Sprague-Dawley yang diberikan 5 perlakuan berbeda. Masing-masing perlakuan terdiri dari 5 ekor tikus putih jantan. Ekstak etanol 70 biji jarak pagar disuspensikan dalam pembawa Na CMC 1 dengan dosis yang telah ditentukan yang diberikan secara oral. Pemberian ekstrak diberikan peroral satu hari sekali setiap pagi hari dan dilakukan selama 48 hari sesuai dengan siklus spermatogenesis Krinke, G.J. 2000.

3.4.7. Pengukuran Parameter

3.4.7.1.Pengukuran Konsentrasi Spermatozoa Pengukuran konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan cara mengambil spermatozoa pada kauda epididimis. Bagian dari kauda epididimis dipotong lalu dikeluarkan cairannya kemudian ditampung diwadah yang berisi NaCl Fisiologis 0,9 sebanyak 500 µL. Spermatozoa dimasukkan kedalam bilik hitung Neubauer Hemasitometer sampai kamar Neubauer terisi rata, kemudian dihitung jumlah spermatozoa pada salah satu kamar hitung Neubauer dan selanjutnya ditentukan pengenceran yang dilakukan dan jumlah kotak yang akan dihitung Tabel 3.2. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 3.2 Pengenceran yang dilakukan dan kotak yang dihitung No. Jumlah Spermatozoa dalam 1 kotak Pengenceran Kotak yang dihitung 1. ≥ 40 50 kali 5 2. 15-40 20 kali 10 3. ≤ 15 10 kali 25 Berdasarkan jumlah spermatozoa yang diketahui, maka dilakukan pengenceran spermatozoa berdasarkan jumlah spermatozoa yang dihitung Ilyas,S. 2007. Tabel 3.3 Cara Pengenceran No. Pengenceran Pembuatan Pengenceran 1. 50 kali a. 980 µL Larutan George + 20 µL spermatozoa b. 2.450 µL Larutan George + 50 µL spermatozoa 2. 20 kali 950 µL Larutan George + 50 µL spermatozoa 3. 10 kali a. 900 µL Larutan George + 100 µL spermatozoa b. 450 µL Larutan George + 50 µL spermatozoa Keterangan: Poin a dan b menunjukkan opsi perlakuan pilih salah satu Tahapan selanjutnya jika telah dilakukan pengenceran, dilakukan perhitungan spermatozoa dengan jumlah kotak yang dihitung sesuai dengan jumlah spermatozoa dan cara pengenceran pada tabel diatas. Kemudian dilakukan pengukuran spermatozoa sesuai rumus dibawah ini � = 10.000 � 25 � Keterangan : n : jumlah spermatozoa yang terhitung. 10.000 : volume kamar hitug Neubauer. Fp : faktor pengenceran yang dilakukan 25 : total kotak kecil yang terdapat dalam kamar hitung Neubauer k : jumlah kotak kecil yang dihitung saat pengamatan v NaCl : volume NaCl mL fisiologis yang digunakan Perhitungan konsentrasi spermatozoa JutamL dapat terlihat dari tabel berikut : Tabel 3.4 Rumus Konsentrasi Spermatozoa No. Jumlah kotak yang dihitung Rumus konsentrasi spermatozoa 1. 5 n x 10.000 x 50 x 5 x 0,5 2. 10 n x 10.000 x 20 x 2,5 x 0,5 3. 25 n x 10.000 x 10 x 1 x 0,5 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.4.7.2.Aktivitas Spermisidal Aktivitas spermisidal ditentukan untuk mengukur konsentrasi minimum zat spermisida yang dibutuhkan untuk membunuh 100 sperma dalam 20 detik. Bahan uji berbagai konsentrasi 0,25 mgmL; 0,5 mgmL; 0,75 mgmL; 1 mgmL; 1,5 mgmL; 2 mgmL; 2,5 mgmL; 3 mgmL; 3,5 mgmL dan 4 mgmL dicampur dengan suspensi sperma dengan perbandingan 1:1 AshishRanjan, Singth, 2013. Campuran tersebut diamati di bawah mikroskop pada perbesaran 40x selama 20 detik lalu diamati motilitas spermanya. Dicatat persen motilitasnya jika ada sperma motil terlihat. Dua ratus lima puluh mikroliter 250 µL Baker’s buffer glukosa 3, Na 2 HPO 4 .2 H 2 O 0,31, NaCl 0,2, KH 2 PO 4 0,01 ditambahkan ke dalam campuran ekstrak dan suspensi sperma yang tidak terdapat sperma motil dan kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama minimal 60 menit. Larutan tersebut dicampurkan perlahan-lahan dan diamati lagi untuk setiap sperma yang motil. Konsentrasi ekstrak yang diuji dicatat sebagai konsentrasi efektif jika kedua tes menunjukkan tidak adanya sperma motil. Konsentrasi minimum dari ekstrak biji jarak pagar yang menyebabkan imobilisasiperhentian semua sperma dalam 20 detik tanpa kebangkitan motilitas dalam larutan buffer setelah 60 menit yang diinkubasi pada suhu 37 o C dianggap sebagai minimum effective concentration MEC Kumbar, S.B., U.C. Jadaramkunti dan R.H. Aladakatti. 2012. 3.4.7.3.Konsentrasi Hormon Testosteron Serum Selama 48 hari tikus diberikan perlakuan dengan cara memberikan ekstrak etanol 70 biji jarak pagar secara oral. Pada hari ke 0 dan 49 dilakukan pengambilan darah melalui ekor lateral tail vein sebanyak ±1 mL kemudian dimasukkan ke dalam tube. Darah dalam tube disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm untuk memisahkan serum yang akan digunakan untuk mengukur kadar testosteron tikus. Serum tersebut disimpan dalam freezer suhu -20 o C sampai hari pengukuran Akmal, Muslim., Chanif Mahdi dan Aulanni’am. 2010. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Pengukuran kadar hormon testosteron serum dilakukan di laboratorium Multiguna dengan menggunakan kit ELISA Testosteron dari DRG International. Kadar hormon minimal yang dapat terdeteksi pada kit ini adalah 0,083 ngmL. Prosedur pengukuran hormon dilakukan berdasarkan instruksi manual yang disertakan dalam kit. Pertama-tama setiap 25 µL dari masing-masing standar, kontrol dan sampel dimasukkan ke dalam sumuran pada plat. Dua ratusmikro liter Enzyme Conjugate dimasukkan ke dalam setiap sumuran dan campur secara menyeluruh selama 10 detik. Plat diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruang tanpa menutup plat. Dengan cepat isi dalam sumuran ditumpahkan kemudian masing-masing sumuran dicuci dengan Wash Solution 400 µL setiap sumuran, proses tersebut diulangi sebanyak tiga kali, lalu plat dibenturkan pada kertas penyerap untuk menghilangkan sisa tetesan pada sumuran. Sebanyak 200 µL Substrate Solution ditambahkan kedalam setiap sumuran lalu inkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Reaksi enzimatik dihentikan dengan menambahkan 100 µL Stop Solution kedalam setiap sumuran. Absorban dari tiap sumuran ditentukan dengan menggunakan microtiter plate ELISA reader pada panjang gelombang 450 ±10nm. Pembacaan sumuran sebaiknya dilakukan dalam 10 menit setelah penambahan Stop Solution.

3.5. Analisis Data

Hasil percobaan yang dianalisis untuk melihat adanya perbedaan yang nyata pada kadar testosteron serum, konsentrasi spermatozoa dan aktivitas spermisidal dari masing-masing kelompok tikus perlakuan. Analisis data yang diperoleh diolah dengan menggunakan program pengolahan data statistik SPSS 16 yang meliputi uji normalitas, uji homogenitas, uji parametrik one-way ANOVA, atau uji non parametrik Kruskal Wallis. Jika hasil dari uji ANOVA maupun uji Kruskal Wallis menunjukkan perbedaan yang signifikan p≤ 0,05 maka analisis data dilanjutkan dengan menggunakan Uji Multiple Comparisons tipe LSD Least Significant DIfference. 37

BAB 4 HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian

4.1.1. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI, Bogor, Jawa Barat. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman uji adalah benar tanaman jarak pagar Jatropha curcas L. dengan familia Euphorbiaceae. Surat pernyataan determinasi dapat dilihat pada Lampiran1.

4.1.2. Ekstraksi

Sebanyak 1,78 kg serbuk biji jarak pagar Jatropha curcas L dimaserasi berulang dengan menggunakan pelarut etanol 70 sebanyak 8000 mL sampai larutan mendekati tidak berwarna. Filtrat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator dan didapatkan ekstrak sejumlah 80,22 gram. Selanjutnya ekstrak di lakukanfreeze dry di LIPI Cibinong hingga diperoleh ekstrak kental sebanyak 37,89 gram. Rendemen yang dihasilkan ialah 2,13. Perhitungan rendemen dapat dilihat pada Lampiran 5.

4.1.3. Penapisan Fitokimia

Berdasarkan hasil penapisan fitokimia yang telah dilakukan terhadap ekstrak etanol biji jarak pagar Jatropha curcas L terdapat beberapa golongan senyawa. Hasil dapat dilihat pada tabel berikut : Tabel 4.1 . Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Etanol Biji Jarak Pagar Golongan Senyawa Hasil Penapisan Tanin - Alkaloid + Flavonoid - Saponin + Terpenoid - Steroid + Keterangan : + memberikan hasil positif, - memberikan hasil negatif