Jenis dan Rancangan Penelitian Alat Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

Variabel-variabel yang digunakan adalah sebagai berikut :

1. Variabel utama

a. Variabel bebas. Variasi dosis pemberian FHEMM. b. Variabel tergantung. Kadar albumin serum tikus betina galur Wistar terinduksi CCl 4 setelah pemberian jangka pendek 6 jam FHEMM.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. Kondisi hewan uji yang digunakan yaitu tikus betina galur Wistar dengan berat badan 130-170 g dan berumur 2-3 bulan, frekuensi pemberian FHEMM satu kali sehari selama enam jam, cara pemberian FHEMM secara per oral dan CCl 4 secara intraperitoniaL. Bahan uji yang digunakan berupa daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. yang diperoleh dari daerah Paingan. b. Variabel pengacau tak terkendali. Kondisi patologis dari tikus betina galur Wistar yang digunakan sebagai hewan uji.

3. Definisi operasional

a. Daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. Daun yang diambil adalah daun yang berwarna hijau, segar, dan tidak bercacat yang dipisahkan dari tulang dan tangkai daunnya. b. Ekstrak metanol-air daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. Ekstrak daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. adalah ekstrak kental yang diperoleh dengan mengekstraksi serbuk kering daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. seberat 40 gram yang dimaserasi ke dalam campuran 100 mL metanol dan 100 mL air selama 24 jam, menggunakan alat orbital shaker dengan kecepatan 140 rpm. Kemudian disaring dengan corong Buchner yang dilapisi dengan kertas saring, kemudian dievaporasi dan diuapkan di dalam oven selama 24 jam pada suhu 45ºC, hingga bobot tetap. c. Fraksi heksan-etanol daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. Fraksi dihasilkan dari proses maserasi ekstrak metanol daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. dengan pelarut heksan etanol 1:1 selama 24 jam menggunakan alat orbital shaker dengan kecepatan putaran 140 rpm. Kemudian disaring dengan corong Buchner yang dilapisi dengan kertas saring lalu di oven selama 24 jam pada suhu 45 ºC. d. Kenaikan Kadar albumin. Kemampuan FHEMM pada dosis tertentu untuk meningkatkan kadar albumin secara signifikan dibandingkan dengan kontrol CCl 4 pada tikus betina galur Wistar terinduksi CCl 4 . e. Pemberian Jangka pendek 6 jam. Pemberian FHEMM daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. satu kali dalam 6 jam. f. Efek Hepatoprotektif. Kemampuan FHEMM daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. yang diberikan secara jangka pendek 6 jam pada dosis tertentu dapat menaikkan kadar albumin pada tikus betina galur Wistar yang terinduksi CCl 4.

C. Bahan Penelitian

1. Bahan utama

a. Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus betina galur Wistar dengan berat badan 130-170 g dan umur 2-3 bulan yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Bahan uji yang digunakan adalah daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. yang diperoleh dari daerah Paingan, Depok, Sleman, Yogyakarta.

2. Bahan kimia

a. Bahan hepatotoksin yang digunakan adalah CCl 4 technical chemical- reagent grade yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis dan Instrumentasi Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. b. Kontrol negatif yang digunakan CMC-Na 1 technical chemical- reagent grade yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi- Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. c. Pelarut hepatotoksin yang digunakan olive oil Bertolli®. Diperoleh dari Laboratorium Farmakologi-Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. d. CMC-Na 1 technical chemical-reagent grade sebagai pelarut FHEMM yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi-Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. e. Metanol , etanol, heksan technical chemical-reagent grade dan aquadest technical chemical-reagent grade yang diperoleh dari toko CV General Labora dekat rs. Sardjito Yogyakarta. f. Reagen serum Albumin BCG Bromcresol Green , TRIS , succinic acid analyzed chemical-reagent grade.

D. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven, timbangan analitik, mesin penyerbuk, ayakan, beaker glass, gelas ukur, pengaduk, cawan porselin, waterbath, stopwatch, kain mori, erlenmeyer, orbital shaker, vaccum rotary evaporator, corong, labu ukur, tabung reaksi, pipet tetes, pipet volume, tabung Eppendorf, pipa kapiler, sentrifuge, spuit injeksi per oral dan ip, syringe 3 cc Terumo®, syringe 1 cc Terumo®, syringe 6 cc Terumo®, dan Microlab 200 Merck®. .

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman Macaranga tanarius L. Müll. Arg.

Determinasi dilakukan dengan mencocokan ciri-ciri tanaman Macaranga tanarius L. Müll. Arg. di Universitas Gadjah Mada Yogyakarta pada buku acuan determinasi dan disesuaikan dengan kunci determinasinya.

2. Pengumpulan bahan uji

Bahan uji yang digunakan adalah daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. yang masih segar dan berwarna hijau, tidak berlubang, tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua, diperoleh dari daerah Paingan, Depok, Sleman, Yogyakarta pada bulan Februari 2015.

3. Pembuatan serbuk

Daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. dicuci bersih dibawah air mengalir. Setelah bersih, daun diangin-anginkan atau dilap dengan lap bersih hingga daun kering kemudian dilakukan pengeringan menggunakan oven. Pengeringan dengan oven dilakukan pada suhu 30ºC selama 72 jam. Setelah kering daun diremas kecil-kecil dan dibuat serbuk lalu diayak dengan ayakan nomor 50. 4. Penetapan kadar air serbuk kering daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. Penetapan kadar air dilakukan dengan metode gravimetri menggunakan alat moisture balance. Pengujian dilakukan dengan cara memasukkan sampel kurang lebih 5 g sampel dan menimbang bobot serbuk sebagai bobot sebelum pemanasan bobot a. Kemudian alat dipanaskan pada suhu 110ºC selama 15 menit, dan setelah itu menimbang bobot serbuk setelah pemanasan bobot b. Selisih bobot a dan b merupakan kadar air dari serbuk daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. yang diselidiki.

5. Pembuatan ekstrak metanol-air daun Macaranga tanarius L. Müll.

Arg. Sebanyak 40 g serbuk kering daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. diekstraksi secara maserasi mekanik dengan merendam serbuk ke dalam campuran 100 mL metanol dan 100 mL air pada suhu kamar selama 24 jam menggunakan alat orbital shaker dengan kecepatan 140 rpm. Setelah itu hasil maserasi disaring menggunakan corong Buchner dilapisi kertas saring. Filtrat dipindahkan ke dalam labu alas bulat untuk dievaporasi. Sisa serbuk di dalam erlenmeyer dilarutkan menggunakan campuran 100 mL metanol dan 100 mL air kemudian dilakukan remaserasi. Proses remaserasi yang dilakukan beberapa kali dapat dihentikan ketika warna filtrat menjadi bening. Hasil evaporasi dituangkan dalam cawan porselin yang telah ditimbang sebelumnya. Cawan porselin yang berisi larutan hasil maserasi dimasukkan dalam oven untuk diuapkan selama 24 jam dengan suhu 45ºC untuk mendapatkan ekstrak metanol-air daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. yang kental hingga didapatkan ekstrak dengan bobot tetap. Rendemen ekstrak merupakan selisih berat cawan berisi ekstrak kental dan berat cawan kosong. Rata-rata rendemen dihitung dari 6 replikasi rendemen ekstrak. Persentase rendemen ekstrak daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. merupakan banyaknya ekstrak kental yang didapatkan dari 1 kg serbuk daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg.

6. Pembuatan FHEMM

Ekstrak pekat ditimbang dan dilarutkan ke dalam pelarut heksan dan etanol 1:1 , volume pelarut disesuaikan dengan bobot ekstrak, perbandingan 1:5. Kemudian dilakukan maserasi mekanik menggunakan alat orbital shaker dengan kecepatan putaran 140 rpm. Hasil maserasi disaring menggunakan kertas saring dan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Sisa ekstrak yang masih ada di dalam erlenmeyer diremaserasi dengan pelarut heksan dan etanol 1:1 kemudian dilakukan remaserasi. Proses remaserasi dapat dihentikan ketika warna filtrat menjadi bening. Filtrat dipisahkan dengan penyarinya dengan alat rotary vaccum evaporator . Kemudian filrat dimasukkan ke dalam cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya. Setelah itu, dimasukkan ke dalam oven selama 24 jam pada suhu 45°C hingga didapatkan fraksi dengan bobot tetap. Rendemen fraksi merupakan selisih berat cawan berisi fraksi dan berat cawan kosong. Rata-rata rendemen dihitung dari jumlah bobot fraksi dari semua replikasi per jumlah replikasi. Persentase rendemen FHEMM didapatkan dari total jumlah bobot fraksi per total jumlah bobot ekstrak kental dikalikan 100.

7. Pembuatan larutan CMC-Na 1 sebagai pelarut ekstrak metanol

Lima gram CMC-Na 1 yang telah ditimbang seksama dimasukkan ke dalam 250 mL air mendidih dan didiamkan selama 24 jam hingga CMC-Na 1 mengembang di dalam gelas beaker. Larutan CMC-Na 1 yang telah mengembang dipindahkan ke labu takar 500 mL dan di add 250 mL sisa air mendidih hingga tanda batas.

8. Pembuatan larutan karbon tetraklorida

Larutan hepatotoksin yang digunakan adalah CCl 4 , dibuat dalam konsentrasi 50 dengan perbandingan CCl 4 dan olive oil sebagai pelarut 1:1 Janakat dan Al-Merie, 2002.

9. Pembuatan larutan sediaan FHEMM

FHEMM ditimbang kemudian diujikan kelarutannya terlebih dahulu di dalam CMC-Na 1. Larutan sediaan FHEMM dibuat dengan melarutkan 600 mg FHEMM dengan 25 mL CMC, hingga diperoleh konsentrasi suspensi FHEMM sebesar 600 mg25 mL.

10. Uji pendahuluan

a. Penetapan dosis toksin karbon tetraklorida. Dosis CCl 4 sebagai hepatotoksik yang digunakan dalam penelitian ini mengacu pada penelitian Janakat dan Al-Merie 2002, bahwa dosis 2 mgkgBB terbukti mampu meningkatkan aktivitas serum ALT dan AST dan penurunan kadar albumin pada tikus bila diberikan secara intraperitonial. b. Penetepan dosis FHEMM Penetapan dosis FHEMM bersifat eksploratif. Dosis tertinggi yang dapat ditetapkan yaitu 137,14 mgkgBB. Peringkat dosis II ditetapkan dengan menurunkan seperdua dari dosis tertinggi ½ x 137,14 mgkgBB = 68,57 mgkgBB dan peringkat dosis I ditetapkan dengan menurunkan seperdua dari peringkat dosis II ½ x 68,57 mgkgBB = 34,28 mgkgBB. c. Penetapan konsentrasi FHEMM Konsentrasi yang digunakan adalah konsentrasi pekat yang dapat dibuat dimana pada konsentrasi tersebut fraksi dapat dimasukkan serta dikeluarkan dari spuit per oral serta fraksi dapat terlarut sempurna dalam pelarut CMC-Na 1. Konsentrasi fraksi yang dapat ditetapkan yaitu 600 mg25 mL. d. Penetapan waktu pencuplikan darah. Hewan uji tikus betina galur Wistar berjumlah 5 ekor. Dimana masing- masing tikus diambil darah pada jam ke-0 setelah pemberian CCl 4 , kemudian diambil darah pada jam ke-24 dan pada jam ke-48 diambil darahnya kembali. Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata.

11. Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji

Hewan uji tikus betina galur Wistar dibagi acak menjadi 6 kelompok, masing-masing 5 ekor. Pengelompokan hewan uji adalah sebagai berikut: a. Kelompok I kelompok kontrol CMC-Na 1 ; 2 mLKgBB . Perlakuan dilakukan secara peroral dan diberikan CMC-Na 1. Pada jam ke-6 setelah pemberian FHEMM diambil darahnya untuk penetapan aktivitas albumin. b. Kelompok II kelompok kontrol CCl 4 ; 2 mLKgBB. Perlakuan dilakukan secara peroral dan diberikan larutan CCl 4 yang telah dilarutkan olive oil. Pada jam ke-6, diambil darahnya untuk penetapan aktivitas albumin. c. Kelompok III kelompok kontrol dosis III tanpa pemberian CCl 4 ; 137,14 mgKgBB. Perlakuan dilakukan peroral dan diberikan sediaan FHEMM. Pada jam ke-6 setelah pemberian FHEMM, diambil darahnya untuk penetapan aktivitas albumin. d. Kelompok IV kelompok dosis I 34,28 mgKgBB FHEMM, diberi CCl 4 yang dilarutkan ke dalam olive oil. Perlakuan dilakukan peroral kemudian diberikan CCl 4 6 jam setelah pemberian sediaan FHEMM. Pada jam ke-24 setelah pemberian CCl 4 , semua kelompok diambil darahnya untuk penetapan aktivitas albumin. e. Kelompok V kelompok dosis II 68,57 mgKgBB FHEMM, diberi CCl 4 yang dilarutkan ke dalam olive oil. Perlakuan dilakukan peroral kemudian diberikan CCl 4 6 jam setelah pemberian sediaan FHEMM. Pada jam ke-24 setelah pemberian CCl 4 , semua kelompok diambil darahnya untuk penetapan aktivitas albumin. f. Kelompok VI kelompok dosis III 137,14 mgKgBB FHEMM, diberi CCl 4 yang dilarutkan ke dalam olive oil. Perlakuan dilakukan peroral kemudian diberikan CCl 4 6 jam setelah pemberian sediaan FHEMM. Pada jam ke-24 setelah pemberian CCl 4 , semua kelompok diambil darahnya untuk penetapan aktivitas albumin.

12. Pembuatan serum

Darah diambil melalui sinus orbitalis mata hewan uji dan ditampung dalam tabung eppendorf dan didiamkan selama 15 menit, lalu disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 4000 rpm, lalu dipisahkan bagian supernatannya. Bagian supernatan yang diperoleh, disentrifugasi lagi dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit.

13. Pengukuran albumin

Architect c8000 merupakan alat yang digunakan untuk mengukur kadar albumin serum dengan metode Brom Cresol Green BCG dan reagen albumin adalah BCG Abbott. Pengukuran albumin dilakukan di Laboratorium Bethesda Yogyakarta.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data kadar albumin dianalisis dengan Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui normalitas data pada masing-masing kelompok perlakuan. Nilai normal suatu data ditunjukkan dengan nilai p0,05. Apabila hasil analisis statistik Kolmogorov-Smirnov kadar serum albumin menunjukkan distribusi data normal p0,05, dilanjutkan dengan analisis One Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan masing-masing kelompok. Setelah itu, dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk melihat kebermaknaan antar kelompok bermakna signifikan p0,05 atau tidak bermakna tidak signifikan p0,05. Jika didapatkan distribusi tidak normal, maka dilakukan analisis data menggunakan uji Kruskal wallis untuk melihat homogenitasnya, dan dilanjutkan dengan uji Mann Whitney untuk melihat perbedaan antar kelompok bermakna. Uji statistika menggunakan IBM SPSS Statistic 22 lisinse UGM. 42

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui dan membuktikan adanya efek hepatoprotektif FHEMM serta mengetahui ada tidaknya kekerabatan dosis pemberian jangka pendek 6 jam FHEMM pada tikus betina galur Wistar terinduksi CCl 4 . Pada penelitian ini aktivitas kadar albumin tikus digunakan sebagai parameter uji kuantitatif.

A. Hasil Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman Macaranga tanarius L. Müll. Arg. dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta atas nama Penina Kurnia Uly sebagai ketua tim penelitian. Determinasi tanaman yang dilakukan yaitu hingga tingkat spesies dengan cara mencocokkan ciri makroskopis tanaman dengan bukti acuan. Bagian tanaman yang dideterminasi yaitu batang, daun, bunga, dan buah. Hasil determinasi adalah benar bahwa tanaman tersebut adalah daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg.

B. Penyiapan Bahan

1. Pembuatan serbuk kering

Daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. dibuat menjadi serbuk kering agar kandungan fitokimia yang terdapat pada daun Macaranga tanarius L. Müll. Arg. lebih mudah tersari oleh pelarut dan senyawa yang diperoleh lebih banyak karena luas permukaan kontak dengan pelarut semakin besar. Hasilnya didapatkan serbuk halus yang melewati ayakan dengan nomor mesh 50.