41
Mengacu pada standar yang telah ditetapkan oleh badan POM yang tercantum pada MA PPOMN 97MIK00 tentang uji Escherichia coli dalam obat
tradisional, maka dipilih 4 macam uji biokimia yang spesifik untuk Escherichia coli yaitu uji indol, uji metil merah, uji voges proskaeur dan uji sitrat.
Uji biokimia juga dilakukan pada kultur murni NIHJ National Institute of Health, Japan sebagai mikroba indikator. Kultur NIHJ akan diperlakukan sama
dengan sampel yang diambil. Hal ini dimaksudkan sebagai pembanding dengan sampel yang telah diambil.
1. Homogenisasi contoh
Persiapan dan homogenisasi sampel meliputi cara persiapan contoh obat tradisional untuk memperoleh distribusi bakteri secara merata didalam contoh yang
diuji. Media yang digunakan adalah Letheen broth. Prinsip dari homogenisasi sample adalah membebaskan sel-sel bakteri yang masih terlindung oleh partikel sampel dan
untuk menggiatkan kembali sel-sel bakteri yang mungkin viabilitasnya menurun karena kondisi yang kurang menguntungkan didalam proses pembuatan obat
tradisional. Sebelum sampel ditempatkan ke dalam media biakan, sampel terlebih
dahulu dihomogenkan. Sampel yang telah ditempatkan ke dalam wadah plastik steril, dibuka dan dipipet sebanyak 10 ml. Pengerjaan dilakukan dalam laminar air flow
untuk menghindari terkontaminasinya bahan sampel. Selanjutnya sampel ditempatkan dalam wadah plastik steril yang baru dan ditambahkan 90 ml larutan
Letheen broth LB. Sampel kemudian dihomogenkan dengan alat homogeniser
sehingga diperoleh pengenceran 1:10.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
2. Tahap pengkayaan
Pada tahap pengkayaan, diambil 10 ml sampel yang telah dihomogenisasi dengan cara dipipet. Pada kultur murni NIHJ dilakukan sebanyak 1 sengkelit. Sampel
dan kultur murni NIHJ kemudian ditambahkan ke dalam masing-masing 90 ml Tryptic soy broth
TSB dan diinkubasi pada suhu 35-37
○
C selama 18-24 jam. Suhu 37
o
C merupakan suhu yang optimum untuk pertumbuhan bakteri Escherichia coli. Tahap pengkayaan dilakukan untuk tetap menjaga pertumbuhan bakteri
Escherichia coli dengan menjaga biakan dalam kondisi yang menguntungkan bagi
pertumbuhan yaitu menjaga pada suhu 37
o
C yang merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan dan memberikan nutrisi yang sesuai. Media Tryptic soy broth TSB
mengandung laktosa yang digunakan untuk memenuhi kebutuhan mikroba.
Gambar 2. Sampel ditempatkan dalam media Tryptic soy brothTSB
3. Tahap isolasi
Media yang digunakan pada tahap isolasi adalah Eosin methylen blue
EMB agar. Media Eosin methylen blueEMB agar yang menggunakan eosin dan metilen blue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
yang meragikan laktosa dan yang tidak. Media Eosin methylen blueEMB agar digunakan karena tidak hanya bersifat selektif tetapi juga diferensial. Media ini
bersifat selektif terhadap organisme gram negatif karena zat warna yang terkandung di dalamnya yaitu anilin akan menghambat pertumbuhan gram positif. Media ini juga
dapat digunakan untuk membedakan koloni dari Escherichia coli dan Enterobacter aerogenes
. Koloni Escherichia coli pada media ini akan berwarna biru kehijauan dengan kemilau metalik, sedangkan koloni Enterobacter aerogenes berwarna grey-
brown dan tidak ada kemilau metalik.
Gambar 3. Mikroba Escherichia coli pada media Eosin methylen blue EMB agar
Keterangan : 1.
Hasil isolasi memberikan warna biru kehijauan dengan kilau metalik 2.
Koloni yang terbentuk ditunjukkan dengan panah A dan B
Pada tahap isolasi, diambil dari biakan pengkayaan dan diinokulasikan 1 sengkelit pada permukaan media Eosin methylen blue EMB agar secara streak
plate dan diinkubasi pada suhu 35-37
○
C selama 24-48 jam, dengan posisi lempeng dibalik. Cara streak plate digunakan supaya didapatkan koloni-koloni bakteri yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
terpisah sehingga mudah untuk diamati. Diamati koloni spesifik yang tumbuh dengan ciri-ciri bentuk bulat, diameter 2-3 mm, warna hijau dengan kilap logam dan bintik
biru kehijuan di tengahnya. Escherichia coli pada media Eosin methylen blue EMB agar
yang merupakan media diferensial akan berwarna hijau dengan kilap logam dan bintik biru kehijauan.
4. Tahap identifikasi dan konfirmasi
