44
terpisah sehingga mudah untuk diamati. Diamati koloni spesifik yang tumbuh dengan ciri-ciri bentuk bulat, diameter 2-3 mm, warna hijau dengan kilap logam dan bintik
biru kehijuan di tengahnya. Escherichia coli pada media Eosin methylen blue EMB agar
yang merupakan media diferensial akan berwarna hijau dengan kilap logam dan bintik biru kehijauan.
4. Tahap identifikasi dan konfirmasi
Koloni yang terbentuk pada Eosin methylen blueEMB agar berwarna biru kehijauan dengan kemilau metalik. Warna yang terbentuk menunjukkan hasil positif
seperti ciri bakteri Escherichia coli. Pada tahap identifikasi dan konfirmasi ini, Dipilih dua atau lebih koloni spesifik pada Eosin methylen blueEMB agar. Koloni
yang diperoleh selanjutnya digoreskan pada nutrient agar miring, kemudian diinkubasi pada suhu 35-37
○
C selama 18-24 jam. Medium nutrient agar miring digunakan untuk memperoleh permukaan
yang lebih luas. Ditinjau secara kimiawi termasuk ke dalam medium sintetik. Medium nutrient agar miring mengandung nutrien yang berguna untuk pertumbuhan
bakteri. Nutrien merupakan substansi anorganik dan organik yang diperoleh dari lingkungan, diperlukan pada biosintesis dan produksi energi dari sel, dan digunakan
sebagai sumber energi untuk mendukung pertumbuhan mikrobia. Nutrien yang pada umumnya diperlukan bakteri adalah makroelemen seperti karbon, oksigen, hidrogen,
nitrogen, sulfur, fosfor, kalsium, magnesium, besi dan mikroelemen seperti mangan, zinc, kobalt, molybdenum dan nikel.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Gambar 4. Media Nutrient agar miring
5. Uji IMVIC
Tahap setelah identifikasi dan konfirmasi adalah pengujian biokimia. Pengujian biokimia dilakukan dengan identifikasi penetapan IMVIC Indol, Metil
merah, Voges proskaeur, Citrate. Pada identifikasi dengan penetapan IMVIC dilakukan empat macam uji meliputi uji metil red, uji indol, uji sitrat dan uji voges-
proskaeur. a.
Uji Indol
Mikroba menggunakan asam amino sebagai pemuka protein, komponen sel dan kadangkala sebagai sumber energi. Asam amino ini dimodifikasi dengan
berbagai cara sewaktu metabolisme. Modifikasi asam amino dapat digunakan untuk pencirian, karena produk yang dihasilkan akibat modifikasi asam amino dapat
digunakan dalam identifikasi mikroba.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dapat dengan mudah digunakan oleh
mikroba akibat penguraian protein. Bakteri seperti Escherichia coli mampu menggunakan triptofan sebagai sumber karbon. Karbon digunakan oleh bakteri untuk
memproduksi karbohidrat dan senyawa-senyawa organik lain yang digunakan sebagai makanan.
Escherichia coli menghasilkan enzim triptofanase yang mengkatalisis
penguraian gugus indol dari triptofan. Dalam media biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan bagian lainnya dari molekul triptofan asam piruvat dan
NH
4 +
dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara mikroba Pembentukan indol dari triptofan oleh mikroba dapat diketahui dengan
menumbuhkannya dalam media Trypton Broth yang kaya dengan triptofan. Triptofan biasanya diberikan dalam bentuk tripton, suatu polipeptida yang kaya dengan residu
triptofan. Penumpukan indol dalam media biakan dapat diketahui dengan penambahan pereaksi Kovacks yang mengandung para-dimetil-aminobenzaldehide
. Reagens ini akan bereaksi dengan indol dan menghasilkan senyawa yang tidak larut
dalam air dan berwarna merah pada permukaan media. Dari biakan NA miring diinokulasikan sebanyak 1 sengkelit pada media
Trypton Broth dan diinkubasi pada suhu 35-37
○
C selama 24-48 jam. Setelah diinkubasi, ke dalam biakan ditambahkan 1 ml pereaksi indolKovacks dikocok dan
didiamkan beberapa menit. Warna merah Cherry yang membentuk cincin pada permukaan biakan menunjukkan reaksi indol positif.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Hasil uji indol menunjukkan 9 sampel memberikan hasil positif yang ditandai dengan terbentuknya cincin berwarna merah pada permukaan media uji
setelah penambahan pereaksi kovacks. Hasil uji indol pada kultur murni NIHJ juga didapatkan hasil positif. Hasil ini menunjukkan terjadinya pembentukan indol. Enam
sampel lainnya memberikan hasil negatif karena tidak terbentuk cincin berwarna merah pada permukaan media uji setelah penambahan pereaksi kovacks. Hasil ini
menunjukkan tidak terjadinya pembentukan indol.
Gambar 5 . Hasil uji indol menggunakan medium Trypton broth Keterangan :
A. Uji indol menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak
terbentuknya cincin berwarna merah pada permukaan media uji setelah penambahan pereaksi kovacks
B. Uji indol menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan
terbentuknya cincin berwarna merah pada permukaan media uji setelah penambahan pereaksi kovacks
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
b. Uji Metil Merah
Kemampuan memfermentasikan berbagai karbohidrat dan produk fermentasi yang dihasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi
mikroba. Hasil akhir fermentasi karbohidrat ditentukan oleh sifat mikroba, media biakan yang digunakan, serta faktor lingkungan, antara lain suhu dan pH. Media
fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasikan dan difermentasikan oleh mikrorganisme. Glukosa termasuk senyawa yang paling sering
digunakan oleh mikroba dalam proses fermentasi itu. Sejumlah besar bakteri gram negatif dapat dikenali berdasarkan produk
akhir yang dihasilkannya bila memfermentasikan laktosa di dalam media MR-VP. Beberapa bakteri seperti Escherichia, Salmonella, Proteus, dan Aeromonas
memfermentasikan laktosa dan menghasilkan banyak asam laktat, suksinat, asetat, dan format
Uji metil merah digunakan untuk mengetahui adanya fermentasi asam campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai
produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media pertumbuhan. Penambahan indikator metil red dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi
asam dengan perubahan warna media menjadi merah, karena indikator ini akan berwarna merah pada pH 4,4 dan berwarna kuning pada pH 6,2. Bila terjadi
fermentasi asam campuran, maka media akan menjadi merah atau merah muda. Tetapi bila tidak terjadi fermentasi asam campuran maka warna media akan tetap
kuning.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
Dari biakan NA miring diinokulasikan sebanyak 1 sengkelit pada media Methyl-Red Voges Proskauer
dan diinkubasi pada suhu 35-37
○
C selama 24-48 jam. Setelah diinkubasi tambahkan 5 tetes larutan metil merah dikocok homogen dan
didiamkan beberapa menit, bila biakan menjadi merah menunjukkan hasil uji positif. Hasil uji metil merah menunjukkan hasil 15 sampel positif yang ditandai
dengan terbentuknya warna merah pada media setelah penambahan metil red. Hasil uji metil merah pada kultur murni NIHJ juga didapatkan hasil positif. Dari hasil uji
ini dapat disimpulkan bahwa mikroba hasil isolasi mampu memfermentasikan asam campuran.
Gambar 6. Hasil uji metil merah menggunakan medium Methyl-
Red Voges Proskauer
Keterangan : Uji metil merah menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan terjadinya perubahan warna pada media uji
menjadi merah setelah penambahan larutan metil red
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
c. Uji Sitrat
Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroba dalam menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Media yang
digunakan adalah Simmon’s citrate agar yang merupakan media sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon NH
4+
sebagai sumber N dan Bromthymol blue sebagai indikator pH. Apabila organisme mampu menggunakan sitrat, maka
asam akan dihilangkan dari media biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna media menjadi biru. Perubahan warna dari hijau menjadi biru
menunjukkan bahwa mikroba mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Dari biakan NA miring diinokulasikan pada media Simmon’s citrate agar
dan diinkubasi pada suhu 35-37
○
C selama 24-48 jam. Jika terjadi perubahan warna biakan menunjukkan hasil uji positif.
Hasil uji sitrat pada mikroba uji hasil isolasi menunjukkan 6 sampel memberikan hasil negatif karena tidak terjadi perubahan warna dari hijau menjadi
biru. Hasil uji sitrat pada kultur murni NIHJ juga didapatkan hasil negatif Hasil ini menunjukkan bahwa mikroba hasil isolasi tidak mampu menggunakan sitrat sebagai
satu-satunya sumber energi. Sembilan sampel lainnya menunjukkan hasil positif karena terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru. Hasil ini menunjukkan
bahwa mikroba hasil isolasi mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber energi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
Gambar 7. Hasil uji sitrat menggunakan medium Simmon’s Citrate Agar
Keterangan : A.
Uji sitrat menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna pada media uji
B. Uji sitrat menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan
terjadinya perubahan warna menjadi biru pada media uji
d. Uji Voges Proskaeur
Uji ini digunakan untuk mengidentifikasi bakteri yang menghasilkan 2,3- butanadiol. Bakteri yang dapat melakukan ini antara lain Enterobacter, Serratia,
Erwinia Hadietomo,1993
Apabila bakteri memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk utama, akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media
pertumbuhan. Penambahan larutan KOH 40 dan larutan alfanaftol dapat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
menentukan adanya asetoin asetilmetilkarbinol yaitu prekursor 2,3-butanadiol. Adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna media menjadi merah muda
karena penambahan larutan KOH 40 dan warna ini semakin diperjelas oleh adanya alfanaftol.
Uji voges proskaeur merupakan uji tidak langsung untuk mengetahui adanya 2,3-butanadiol, tetapi karena asetoin adalah senyawa pendahulu 2,3-
butanadiol dan selalu didapatkan serentak, sehingga uji voges proskaeur dapat digunakan untuk menentukan adanya 2,3-butanadiol.
Gambar 8. Hasil uji Voges Proskauer menggunakan medium Methyl-Red Voges Proskauer
Keterangan : Uji Voges Proskauer menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna pada
media uji setelah penambahan larutan alfa naftol dan larutan KOH 40
Dari biakan NA miring diinokulasikan pada media Methyl-Red Voges Proskauer
dan diinkubasi pada suhu 35-37
○
C selama 24-48 jam. Setelah diinkubasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
tambahkan 12 tetes larutan alfa naftol dan 4 tetes larutan KOH 40, dikocok kemudian didiamkan selama 2-4 jam. Jika warna biakan menjadi merah muda hingga
merah menyala menunjukkan reaksi positif. Pada uji voges proskaeur diperoleh hasil 15 sampel negatif karena tidak
terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah pada media. Hasil uji voges proskaeur pada kultur murni NIHJ juga didapatkan hasil negatif Hasil ini
menunjukkan mikroba uji memfermentasikan karbohidrat tetapi tidak lewat jalur 2,3- butanadiol melainkan lewat jalur asam campuran seperti pada hasil uji metil merah.
Keputusan Menteri kesehatan No 661 tahun 1994 tentang persyaratan obat tradisional menyebutkan bahwa dalam obat tradisional tidak boleh mengandung
mikroba patogen seperti Escherichia coli. Berdasarkan literatur yang tercantum dalam Metode Analisis Pusat Pengujian Obat dan Makanan MAPPOMN
No.97MIK00 tentang uji Escherichia coli pada obat tradisional, hasil uji tes biokimia IMVIC untuk mikroba uji Escherichia coli yang menunjukkan hasil positif
dapat ditunjukkan pada tabel berikut
Tabel II. Tabel hasil uji biokimia IMVIC pada Escherichia coli
No Uji biokimia Hasil
Keterangan 1
Indol Terbentuk cincin berwarna merah
pada permukaan biakan Positif
2 Metil merah Media menjadi berwarna merah
Positif 3
Voges Proskaeur
Tidak terjadi perubahan warna pada media menjadi merah
Negatif 4
Sitrat Tidak terjadi perubahan warna
pada media menjadi biru Negatif
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
Jamu beras kencur dibuat dalam skala rumah tangga dan dijajakan sendiri oleh pembuatnya sehingga belum ada keseragaman kualitas baik keamanan maupun
kebersihan yang terstandarisasi. Keseluruhan hasil pengujian tes biokimia IMVIC untuk mikroba uji Escherichia coli pada sampel jamu gendong beras kencur pada 5
penjual jamu gendong beras kencur tradisional yang terdapat di pasar Pingit, pasar Kranggan dan pasar Karangwaru di kotamadya Yogyakarta dapat ditunjukkan pada
tabel berikut :
Tabel III. Tabel hasil uji biokimia IMVIC pada sampel jamu beras kencur
Hasil uji IMVIC Sampel Pengambilan
ke- Indol
Metil red Voges-
proskaeur Sitrat
1 positif
positif negatif
negatif 2
negatif positif
negatif positif
A 3
positif positif
negatif negatif
1 negatif
positif negatif
positif 2
negatif positif
negatif positif
B 3
negatif positif
negatif positif
1 positif
positif negatif
positif 2
positif positif
negatif negatif
C 3
positif positif
negatif negatif
1 positif
positif negatif
positif 2
positif positif
negatif negatif
D 3
negatif positif
negatif positif
1 positif
positif negatif
negatif 2
negatif positif
negatif positif
E 3
negatif positif
negatif positif
Kontrol positif
positif negatif
negatif
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
Dari tabel III, dapat diketahui pada beberapa sampel jamu beras kencur yang diedarkan oleh 5 penjual jamu gendong tradisional di 3 pasar di kotamadya
Yogyakarta positif mengandung bakteri Escherichia coli yang ditunjukkan dengan uji indol dan metil merah yang menunjukkan reaksi positif serta uji voges proskaeur
dan sitrat yang menunjukkan hasil negatif. Data tersebut dapat dirangkum dan disajikan pada tabel berikut :
Tabel IV. Tabel hasil identifkasi Escherichia coli dilihat dari tiap penjual jamu
Penjual Pengambilan ke- Hasil identifikasi Keterangan
1 positif
2 negatif
A 3
positif Tidak memenuhi syarat
1 negatif
2 negatif
B 3
negatif Memenuhi syarat
1 negatif
2 positif
C 3
positif Tidak memenuhi syarat
1 negatif
2 positif
D 3
negatif Tidak memenuhi syarat
1 positif
2 negatif
E 3
negatif Tidak memenuhi syarat
Dari tabel IV dapat dilihat bahwa dari 5 penjual jamu gendong tradisional
yang menjual jamu beras kencur di tiga pasar di kotamadya Yogyakarta, 4 orang penjual tersebut menjajakan jamu beras kencur yang positif mengandung mikroba
patogen Escherichia coli, sedangkan 1 orang penjual yaitu penjual B menjajakan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
jamu beras kencur yang tidak mengandung mikroba patogen Escherichia coli. Dari tabel 3 juga dapat dilihat, 15 sampel jamu gendong beras kencur yang diambil, 6
sampel positif mengandung bakteri Escherichia coli.
6. Pengecatan gram
