dan minyak cengkeh serta diberi oksigen sebanyak 1 : 4. Kantung plastik diikat dengan karet hingga tidak ada udara yang keluar. Kantung plastik yang sudah
dikemas dimasukkan ke dalam kotak Styrofoam dan di dalamnya diisi dengan es. Pengamatan keadaan ikan berupa tingkat kelangsungan hidup dilakukan setiap 6
jam dan pengambilan sampel air sebanyak 50 mL per kantong setiap 24 jam untuk pengamatan kualitas air.
3.2.5 Prosedur Pengukuran Kortisol dengan HPLC AOAC 1999
Sampel diambil sebanyak 1 gr atau satu ekor ikan. Kemudian Ikan dimatikan dengan cepat, agar kondisi stres yang dialami tidak meningkatkan
konsentrasi hormon kortisol pada ikan. Ikan yang sudah dimatikan diekstrak dengan cara : 1 gram sampel dimasukkan ke dalam tabung teflon kemudian
ditambahkan 5 L standar sampel 0,62 nMol = 200 ng cortisol dan ditambahkan 10 mL dichloro methan. Sampel dikocok selama 5 menit dan disentrifuge pada
kecepatan 1300 rpm. Sampel didiamkan selama 15 menit pada suhu 20°C. Buang bagian yang jernih yang terdapat pada sampel yang telah disentrifuge, kemudian
tambahkan 1 ml NaOH 0,1 M. Kemudian sampel dikocok selama 1 menit dan disentrifuge dengan kecepatan 1300 rpm lalu didiamkan selama 5 menit pada
suhu 20°C. Setelah itu buang bagian atas sampel yang disentrifuge dengan cepat lalu ditambahkan 1 ml air serta kocok selama 1 menit dan disentrifuge dengan
kecepatan 1300 rpm lalu didiamkan selama 5 menit pada suhu 20°C ulangi sebanyak 2 kali. Keringkan larutan dichloro methan dibawah vacuum, larutan
kortisol yang telah kering ditambahkan dengan 100 l H
2
O + alkohol. Biarkan selama 5 menit, kemudian saring dengan 0.5 milliphore.
Setelah diekstrak sampel diinject ke alat HPLC dengan detector 254 nm. Plak sampel dan standar sampel dibandingkan dengan sepadex atau luas area
contoh, maka akan diperoleh konsentrasi ppm sampel kortisol.
3.2.6 Prosedur Pengukuran Gambaran darah
1 Penghitungan jumlah sel darah merah Eritrosit Darah diambil dari ikan dengan menggunakan injeksi yang terlebih dahulu
telah diisi dengan cairan antikoagulan untuk mencegah terjadinya penggumpalan darah. Darah yang tersedot dimasukkan kedalam ependorf, dan kemudian darah
dihisap dengan menggunakan pipet pencampur sampai dengan skala 0,5 dan
ditambahkan dengan larutan hayems yang dihisap dengan menggunakan pipet yang sama hingga mencapai skala 101. Setelah itu, pipet digoyanglan membentuk
angka delapan selama 3-5 menit. Tetesan pertama dibuang dan tetesan berikutnya diteteskan kedalam haemocytometer dan ditutup dengan kaca penutup.
Penghitungan dilakukan pada 5 kotak kecil yaitu pada sudut kiri atas, sudut kanan atas, sudut kiri bawah, sudut kanan bawah dan pada bagian tengah. Jumlah sel
darah merah yang terhitung dikonversikan dengan rumus :
Jumlah sel darah merah = ∑ sel darah merah terhitung x 10
4
selmm
3
.
2 Penghitungan jumlah sel darah putih Metode pengambilan darahnya sama dengan metode pengambilan darah
merah. Darah dihisap dengan pipet pencampur sampai dengan skala 11 dan ditambahkan larutan turk. Kemudian pipet digoyangkan hingga membentuk angka
delapan selama 3-5 menit. Tetesan pertama dibuang, dan tetesan selanjutnya diteteskan diatas haemocytometer lalu ditutup dengan kaca penutup.
Penghitungan dilakukan pada 5 kotak besar. Jumlah sel darah putih yang terhitung dikonversikan dengan rumus
Jumlah sel darah putih = ∑ sel darah putih terhitung x 50 selmm
3
3 Pengukuran kadar hematokrit Menggunakan Microhematocrit method, darah dimasukkan kedalam tabung
mikrohematokrit sampai 45 bagian. Kemudian salah satu ujung tabung disumbat dengan crestaseal. Darah disentrifuge pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit.
Setelah itu akan terbentuk lapisan-lapisan yang terdiri dari lapisan plasma yang jernih di bagian atas, kemudian lapisan putih abu-abu buffy coat yang
merupakan trombosit dan leukosit dan lapisan eritrosit yang berwarna merah. Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur persentase volume eritrosit dari
darah dengan menggunakan alat baca mikrohematokrit Microcapillary hematocrit reader
dan dinyatakan dalam persentase Ht. 4 Kadar Haemoglobin Hb
Pengukuran kadar haemoglobin pada prinsipnya adalah mengkonversikan haemoglobin dalam darah ke dalam bentuk asam hematin oleh asam klorida.
Mula-mula darah diisap menggunakan pipet sahli hingga skala 20 mm
3
. Kemudian dipindahkan ke dalam tabung Hb yang berisi HCl 0.1 N sampai skala
10 kuning. Didiamkan selama 3–5 menit agar Hb bereaksi dengan HCl membentuk asam hematin, kemudian diaduk dan ditambahkan aquadestila sedikit
demi sedikit hingga warnanya sama dengan standar. Pembacaan skala dilakukan dengan melihat tinggi permukaan larutan yang dikocok dengan skala lajur g
yang menunjukkan banyaknya Hb dalam gram setiap 100 ml darah dan dinyatakan dalam persentase Hb.
5 Diferensiasi Leukosit Satu tetes darah diteteskan di atas gelas objek yang bersih. Dengan
menggunakan gelas objek yang lain darah disinggungkan sehingga antara kedua objek gelas tersebut membentuk sudut
30. Setelah itu darah didorong ke arah depan dengan tidak mengubah sudut kedua objek gelas tersebut. sediaan darah
yang tipis setelah dikeringanginkan difiksasi selama 5 menit. Sediaan yang telah
difiksasi kemudian diwarnai dengan zat warna Giemsa selama 30 menit.
Sediaan diangkat dan kelebihan zat warna dibilas dengan air kran. Kemudian dikeringanginkan dan siap untuk diamati. Pengamatan pada sediaan apusan
ditunjukkan untuk menghitung rasio jumlah trombosit dan eritrosit.
3.2.7 Prosedur Histologi
