3.3.3. Penjebakan biofilm bakteri
Penjebakan biofilm bakteri adalah suatu proses untuk mendapatkan bakteri pembentuk biofilm dengan cara menunggu hingga bakteri tersebut terjebak pada
substrat yang telah disipkan dalam rentang waktu tertentu. Penjebakan dilakukan dengan menggunakan substrat berupa empat buah balok kayu steril berukuran 3 x
6 cm
2
. Balok kayu tersebut kemudian diikatkan pada penyangga besi dengan menggunakan tali pengikat dan dipasang secara sirkular Gambar 4. Hal tersebut
bertujuan supaya bakteri dapat terjebak dalam kondisi apapun. 6 cm
3 cm
Gambar 4. Proses penjebakan biofilm bakteri pada substrat kayu
Substrat jebakan dipasang pada lokasi di sekitar ekosistem karang lunak dengan cara dibenamkan pada kedalaman 1 meter di bawah permukaan laut
selama 1 minggu. Setelah 1 minggu pembenaman, substrat diambil dan dimasukkan dalam kantong plastik berisi air laut. Selanjutnya disimpan dalam
kontainer pendingin berisi es untuk ditransportasikan ke laboratorium.
3.3.4. Isolasi Bakteri Asosiatif Karang Lunak
Isolasi merupakan suatu proses pemisahan bakteri tertentu dari populasi campuran. Metode yang digunakan untuk isolasi bakteri yang berasosiasi dengan
karang lunak adalah metode cawan sebar. Tahapan isolasinya adalah sebagai
berikut: karang lunak segar dicuci dengan menggunakan air laut steril sebanyak tiga kali triturasi. Hal tersebut bertujuan untuk menghilangkan bakteri non target
bakteri non simbion. Kemudian dilakukan pengerokan terhadap permukaan jaringan dengan alat pengerok steril. Selanjutnya dilakukan seri pengenceran
terhadap sampel tersebut. Sebanyak 10 gram sampel hasil kerokan dimasukkan ke dalam air laut steril 90 ml dan diperoleh pengenceran sampel sebesar 10
-1
. Dari pengenceran 10
-1
tersebut diambil 1 ml sampel dengan pipet steril dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml air laut steril dan diperoleh
pengenceran 10
-2
. Demikian selanjutnya sehingga diperoleh pengenceran sampel sampai 10
-6
. Masing-masing hasil pengenceran 10
-3
, 10
-4
dan 10
-5
diambil 100 μl diteteskan dalam cawan petri steril berisi 20 ml media SWC. Gambar 5.
10 gram 1 ml
1 ml 1 ml
1 ml 1 ml
10 gram sampel hasil kerikan
90 ml 10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-1
air laut steril Air laut steril 9 ml
0,1 ml 1 1 1
0,1 ml 2 2 2
0,1 ml 3 3 3 Gambar 5. Proses isolasi bakteri asosiasi karang lunak
Selanjutnya disebar dengan menggunakan batang penyebar steril dan diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37
C suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri Pelczar dan Chan, 2005. Setelah inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh
pada masing-masing cawan dihitung dan diamati. Koloni-koloni dengan bentuk, warna, elevasi, dan tepian koloni berbeda diisolasi dan dilakukan pengamatan
bentuk sel dan pewarnaan Gram Lampiran 2. Semua alat dan bahan yang digunakan dilakukan sterilisasi terlebih dahulu dengan autoklaf Lampiran 3.
3.3.5. Isolasi Bakteri Pembentuk
Biofilm
Biofilm bakteri disiapkan dengan tujuan memperoleh isolat bakteri pembentuk biofilm. Metode yang digunakan untuk isolasi bakteri pembentuk
biofilm adalah metode cawan sebar Gambar 6. Tahapan isolasinya adalah sebagai berikut: substrat yang telah dipasang di perairan laut selanjutnya diambil
pada waktu perendaman 1 minggu. Substrat selajutnya dicuci menggunakan air laut steril dengan cara disemprokan sebanyak tiga kali triturasi. Hal tersebut
bertujuan untuk memastikan bahwa bakteri yang terisolasi adalah bakteri pembentuk biofilm yang sudah permanen. Substrat selanjutnya dimasukkan ke
dalam cawan petri steril yang sebagian berisi air laut steril. Kemudian dilakukan pengerokan terhadap permukaan substrat dengan alat pengerok steril secara
aseptik. Selanjutnya dilakukan seri pengenceran terhadap sampel hasil kerokan dan proses isolasi dilakukan dengan prosedur yang sama dengan isolasi bakteri
asosiasi karang lunak. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 C
selama 2 x 24 jam. Setelah inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh pada masing-masing cawan dihitung
dan diamati. Koloni-koloni dengan bentuk, warna, elevasi, dan tepian koloni berbeda diisolasi dan dilakukan pengamatan bentuk sel dan pewarnaan Gram.
Gambar 6. Proses isolasi bakteri pembentuk biofilm
3.3.6. Uji Hambat Uji Antagonisme Bakteri Asosiatif Karang Lunak terhadap Pertumbuhan Bakteri Pembentuk
Biofilm
Kegiatan uji hambat pertumbuhan dilakukan antara isolat bakteri asosiatif karang lunak terhadap bakteri pembentuk biofilm dengan metode difusi agar
Radjasa, 2004. Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri pembentuk biofilm. Tahapan dari uji ini meliputi persiapan media cair dan persiapan media padat
Lampiran 4. Sebanyak 20 ml media agar SWC dalam keadaan cair ditambahkan 20 μl bakteri pembentuk biofilm dan dihomogenkan dengan vortex,
kemudian segera dituangkan ke dalam cawan petri steril. Cawan petri yang telah berisi campuran media SWC dan bakteri pembentuk biofilm tersebut didiamkan
sekitar 15 menit atau sampai media membeku. Selanjutnya beberapa paper disk steril diameter 6 mm diletakkan secara aseptik pada permukaan agar dan
sebanyak 20 µl kultur cair bakteri asosiasi karang lunak diteteskan di atas paper disk. Sebagai kontrol positif digunakan antibiotik ampicillin sigma konsentrasi
100 ppm sebanyak 20 µl. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C selama 2 x 24 jam.
Aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan adanya zona bening zona hambatan disekitar paper disk dan dibandingkan dengan aktivitas antibiotik ampicillin
Murniasih dan Rasyid, 2010. Diameter zona bening diukur dengan menggunakan jangka sorong dengan ketelitian 0,1 mm Lampiran 5.
3.3.7. Uji Hambat Uji Antagonisme Bakteri Asosiatif Karang Lunak terhadap Pembentukkan