3. METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan mulai bulan Mei sampai Agustus 2011. Lokasi pengambilan sampel karang lunak serta penjebakan biofilm bakteri dilakukan di
perairan pulau Pramuka, Kepulauan Seribu, DKI Jakarta Gambar 3. Isolasi bakteri, serta uji hambat dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, FMIPA, IPB.
Identifikasi karang lunak dilakukan di Laboratorium Kering Biologi Laut, ITK, FPIK, IPB. Analisis kualitas perairan dilakukan di Laboratorium Produktivitas
Lingkungan Proling, FPIK, IPB.
Gambar 3. Peta lokasi pengambilan sampel karang lunak dan penjebakan biofilm bakteri
3.2. Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan di lapang meliputi peralatan scuba diving, under water camera, GPS Garmin 12 CX, sacchi disk, refraktometer, plastik tahan
panas, botol sampel, kontainer pendingin, thermometer dan substrat jebakan. Sedangkan peralatan yang digunakan di Laboratorium meliputi mikroskop, cawan
petri, spatula, mortar, erlenmeyer, vortex stirrer, timbangan analitik, tabung reaksi, batang penyebar, jarum ose, laminar air flow, paper disk diameter 6 mm,
spektrofotometer, dan jangka sorong. Bahan yang digunakan di lapangan meliputi es batu dan air laut. Sementara
bahan yang digunakan di laboratorium meliputi sampel karang lunak segar, akuades, air laut, media Sea Water Complex SWC padat dan cair, alkohol 70,
dan antibiotik ampicilin sigma konsentrasi 100 ppm.
3.3. Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan untuk mencari bakteri asosiasi karang lunak yang potensial sebagai alternatif teknologi ramah lingkungan untuk mengontrol
biofouling di laut. Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu: 3.3.1. Koleksi dan Pengambilan Sampel Karang Lunak
Metoda sampling yang digunakan adalah metoda purposive sampling dimana pengambilan sampel terfokus pada target dengan mempertimbangkan
kriteria-kriteria tertentu terhadap obyek yang sesuai dengan tujuan penelitian Fachrul, 2007. Dalam hal ini penelitian dilakukan terhadap karang lunak jenis
Sinularia dura dan Lobophytum strictum yang mana berdasarkan Radjasa et al. 1999 karang lunak tersebut mampu menghasilkan senyawa bioaktif yang dapat
menghambat pertumbuhan bakteri pembentuk biofilm. Kedua sampel diambil pada kedalaman 5 meter, di bagian barat 105
63’09” BT dan 5 74’52” LS pulau
Pramuka dengan peralatan scuba diving set. Sampel karang lunak jenis Sinularia
dura dan Lobophytum strictum yang belum mendapat sentuhan difoto untuk kepentingan identifikasi. Sampel karang lunak selanjutnya dibawa ke permukaan
air secara perlahan dan dimasukkan dalam kantong plastik tahan panas berisi air laut. Selanjutnya disimpan dalam kontainer pendingin berisi es untuk
ditransportasikan ke laboratorium.
3.3.2. Identifikasi Sampel Karang Lunak
Identifikasi sampel karang lunak dilakukan di Laboratorium Kering Biologi Laut, FPIK, IPB. Sedangkan buku panduan dan teknik identifikasi mengacu pada
Fabricius dan Alderslade 2001 dan Manuputty 2002. Identifikasi sampel karang lunak dilakukan melalui beberapa tahap Lampiran 1, yaitu:
1 Foto bawah air dari sampel karang lunak uji dicocokkan dengan foto bawah
air jenis-jenis karang lunak yang ada pada buku identifikasi. Hal tersebut dilakukan untuk mengetahui genus dari karang lunak uji.
2 Sampel karang lunak segar dipotong menjadi dua bagian yaitu bagian atas
top dan bagian bawah basal. Hal tersebut bertujuan untuk mengetahui bentuk spikula pada masing-masing bagian karang lunak. Cuplikan jaringan
dari setiap bagian karang lunak diletakkan di atas gelas objek, kemudian diberi larutan pemutih dengan tujuan untuk melarutkan jaringan karang.
Selanjutnya dilakukan pencucian dengan air untuk menghilangkan larutan pemutih dan sisa jaringan. Spikula dari masing-masing bagian karang lunak
diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 40. 3
Spikula yang teramati dari masing-masing bagian karang lunak difoto dan dicocokkan dengan literatur untuk mengetahui spesies dari karang lunak uji.
3.3.3. Penjebakan biofilm bakteri
Penjebakan biofilm bakteri adalah suatu proses untuk mendapatkan bakteri pembentuk biofilm dengan cara menunggu hingga bakteri tersebut terjebak pada
substrat yang telah disipkan dalam rentang waktu tertentu. Penjebakan dilakukan dengan menggunakan substrat berupa empat buah balok kayu steril berukuran 3 x
6 cm
2
. Balok kayu tersebut kemudian diikatkan pada penyangga besi dengan menggunakan tali pengikat dan dipasang secara sirkular Gambar 4. Hal tersebut
bertujuan supaya bakteri dapat terjebak dalam kondisi apapun. 6 cm
3 cm
Gambar 4. Proses penjebakan biofilm bakteri pada substrat kayu
Substrat jebakan dipasang pada lokasi di sekitar ekosistem karang lunak dengan cara dibenamkan pada kedalaman 1 meter di bawah permukaan laut
selama 1 minggu. Setelah 1 minggu pembenaman, substrat diambil dan dimasukkan dalam kantong plastik berisi air laut. Selanjutnya disimpan dalam
kontainer pendingin berisi es untuk ditransportasikan ke laboratorium.
3.3.4. Isolasi Bakteri Asosiatif Karang Lunak
Isolasi merupakan suatu proses pemisahan bakteri tertentu dari populasi campuran. Metode yang digunakan untuk isolasi bakteri yang berasosiasi dengan
karang lunak adalah metode cawan sebar. Tahapan isolasinya adalah sebagai
berikut: karang lunak segar dicuci dengan menggunakan air laut steril sebanyak tiga kali triturasi. Hal tersebut bertujuan untuk menghilangkan bakteri non target
bakteri non simbion. Kemudian dilakukan pengerokan terhadap permukaan jaringan dengan alat pengerok steril. Selanjutnya dilakukan seri pengenceran
terhadap sampel tersebut. Sebanyak 10 gram sampel hasil kerokan dimasukkan ke dalam air laut steril 90 ml dan diperoleh pengenceran sampel sebesar 10
-1
. Dari pengenceran 10
-1
tersebut diambil 1 ml sampel dengan pipet steril dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml air laut steril dan diperoleh
pengenceran 10
-2
. Demikian selanjutnya sehingga diperoleh pengenceran sampel sampai 10
-6
. Masing-masing hasil pengenceran 10
-3
, 10
-4
dan 10
-5
diambil 100 μl diteteskan dalam cawan petri steril berisi 20 ml media SWC. Gambar 5.
10 gram 1 ml
1 ml 1 ml
1 ml 1 ml
10 gram sampel hasil kerikan
90 ml 10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-1
air laut steril Air laut steril 9 ml
0,1 ml 1 1 1
0,1 ml 2 2 2
0,1 ml 3 3 3 Gambar 5. Proses isolasi bakteri asosiasi karang lunak
Selanjutnya disebar dengan menggunakan batang penyebar steril dan diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37
C suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri Pelczar dan Chan, 2005. Setelah inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh
pada masing-masing cawan dihitung dan diamati. Koloni-koloni dengan bentuk, warna, elevasi, dan tepian koloni berbeda diisolasi dan dilakukan pengamatan
bentuk sel dan pewarnaan Gram Lampiran 2. Semua alat dan bahan yang digunakan dilakukan sterilisasi terlebih dahulu dengan autoklaf Lampiran 3.
3.3.5. Isolasi Bakteri Pembentuk
Biofilm
Biofilm bakteri disiapkan dengan tujuan memperoleh isolat bakteri pembentuk biofilm. Metode yang digunakan untuk isolasi bakteri pembentuk
biofilm adalah metode cawan sebar Gambar 6. Tahapan isolasinya adalah sebagai berikut: substrat yang telah dipasang di perairan laut selanjutnya diambil
pada waktu perendaman 1 minggu. Substrat selajutnya dicuci menggunakan air laut steril dengan cara disemprokan sebanyak tiga kali triturasi. Hal tersebut
bertujuan untuk memastikan bahwa bakteri yang terisolasi adalah bakteri pembentuk biofilm yang sudah permanen. Substrat selanjutnya dimasukkan ke
dalam cawan petri steril yang sebagian berisi air laut steril. Kemudian dilakukan pengerokan terhadap permukaan substrat dengan alat pengerok steril secara
aseptik. Selanjutnya dilakukan seri pengenceran terhadap sampel hasil kerokan dan proses isolasi dilakukan dengan prosedur yang sama dengan isolasi bakteri
asosiasi karang lunak. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 C
selama 2 x 24 jam. Setelah inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh pada masing-masing cawan dihitung
dan diamati. Koloni-koloni dengan bentuk, warna, elevasi, dan tepian koloni berbeda diisolasi dan dilakukan pengamatan bentuk sel dan pewarnaan Gram.
Gambar 6. Proses isolasi bakteri pembentuk biofilm
3.3.6. Uji Hambat Uji Antagonisme Bakteri Asosiatif Karang Lunak terhadap Pertumbuhan Bakteri Pembentuk
Biofilm
Kegiatan uji hambat pertumbuhan dilakukan antara isolat bakteri asosiatif karang lunak terhadap bakteri pembentuk biofilm dengan metode difusi agar
Radjasa, 2004. Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri pembentuk biofilm. Tahapan dari uji ini meliputi persiapan media cair dan persiapan media padat
Lampiran 4. Sebanyak 20 ml media agar SWC dalam keadaan cair ditambahkan 20 μl bakteri pembentuk biofilm dan dihomogenkan dengan vortex,
kemudian segera dituangkan ke dalam cawan petri steril. Cawan petri yang telah berisi campuran media SWC dan bakteri pembentuk biofilm tersebut didiamkan
sekitar 15 menit atau sampai media membeku. Selanjutnya beberapa paper disk steril diameter 6 mm diletakkan secara aseptik pada permukaan agar dan
sebanyak 20 µl kultur cair bakteri asosiasi karang lunak diteteskan di atas paper disk. Sebagai kontrol positif digunakan antibiotik ampicillin sigma konsentrasi
100 ppm sebanyak 20 µl. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C selama 2 x 24 jam.
Aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan adanya zona bening zona hambatan disekitar paper disk dan dibandingkan dengan aktivitas antibiotik ampicillin
Murniasih dan Rasyid, 2010. Diameter zona bening diukur dengan menggunakan jangka sorong dengan ketelitian 0,1 mm Lampiran 5.
3.3.7. Uji Hambat Uji Antagonisme Bakteri Asosiatif Karang Lunak terhadap Pembentukkan
Biofilm
Bakteri uji yang digunakan dalam uji hambat ini adalah biofilm bakteri kumpulan dari beberapa jenis bakteri pembentuk biofilm. Kegiatan uji hambat
dilakukan dengan metode difusi agar Radjasa, 2004. Sebanyak 20 ml media agar SWC dalam keadaan cair ditambahkan 20 μl biofilm bakteri dan dihomogenkan
dengan vortex, kemudian segera dituangkan ke dalam cawan petri steril. Cawan petri yang telah berisi campuran media SWC dan biofilm bakteri tersebut
didiamkan sekitar 15 menit sampai media membeku. Selanjutnya beberapa paper disk steril diameter 6 mm diletakkan secara aseptik pada permukaan agar dan
sebanyak 20 µl kultur cair bakteri asosiasi karang lunak diteteskan di atas paper disk. Sebagai kontrol positif digunakan antibiotik ampicillin sigma konsentrasi
100 ppm sebanyak 20 µl. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C selama 2 x 24 jam.
Aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan adanya zona bening zona hambatan disekitar paper disk dan dibandingkan dengan aktivitas antibiotik ampicillin
Murniasih dan Rasyid, 2010. Diameter zona bening diukur dengan menggunakan jangka sorong dengan ketelitian 0,1 mm.
3.3.8. Analisis Data
Analisis data yang digunakan pada penelitian ini menggunakan analisis deskriptif kualitatif. Analisis tersebut diperoleh berdasarkan tabel dan gambar,
serta melihat ukuran diameter zona hambat bakteri asosiatif terhadap biofilm bakteri. Isolat bakteri asosiasi yang memiliki zona hambat paling tinggi terhadap
ketiga bakteri uji dijadikan sebagai isolat terpilih sebagai sumber anti- microfouling.
3.4. Diagram Alir Penelitian
Berikut merupakan diagram alir penelitian disajikan pada Gambar 7.
Gambar 7. Diagram alir penelitian Isolasi bakteri
asosiasi karang lunak
Isolasi bakteri pembentuk
biofilm Penjebakan
Biofilm bakteri
Pengambilan sampel karang
lunak Kultur murni
bakteri asosiasi
Kultur murni bakteri
pembentuk biofilm
Uji Antagonisme
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Pengamatan Parameter Fisika-Kimia Perairan
Kondisi lingkungan fisika-kimia habitat merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi produksi senyawa metabolit sekunder karang lunak. Karang lunak
merupakan organisme yang memiliki sifat toleransi yang tinggi terhadap ekologi perairan Dinensen et al., 1983. Walaupun demikian, terdapat beberapa faktor
yang tidak dapat ditolerir seperti kekeringan yang terlalu lama, endapan yang tebal, dan penurunan kadar garam yang drastis. Data pendukung berupa hasil
analisis parameter fisika-kimia pada lokasi pengambilan sampel disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil analisis parameter kualitas lingkungan perairan fisika-kimia pada lokasi pengambilan sampel karang lunak
No Parameter
Unit Lokasi
Barat pulau Pramuka Baku mutu
Fisika
1 Suhu
C 31
28-30 2
Kadar garam ppt
33 33-34
3 Kecerahan
100 5
Kimia
1 TSS
mgl 37
20 2
Derajat Keasaman pH
8,17 7-8,5
3 Nitrat
mgl 0,0032
0,008 4
Fosfat mgl
0,0099 0,015
5 COD
mgl 52,2941
80
Keterangan: Keputusan Menteri Lingkungan Hidup No. 51 tahun 2004 untuk Biota Perairan Laut
Bapedalda DKI Jakarta – LP ITB, 1998
Kedua jenis sampel karang lunak dikoleksi pada lokasi yang sama yaitu pada perairan Barat pulau Pramuka. Secara keseluruhan dapat dikatakan bahwa
perairan pada lokasi pengambilan sampel masih berada pada kisaran baku mutu