Alat dan Instrument Penelitian Analisis Hasil

j. Xylol sebagai clearing agent dan pewarnaan HE yang diperoleh dari Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. k. Parafin sebagai bahan impregnasi yang diperoleh dari Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. l. Harris-Hematoxyline sebagai pewarna dalam pewarnaan HE yang diperoleh dari Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. m. Acid Alkohol sebagai larutan untuk pewarnaan HE yang diperoleh dari Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. n. Eosin sebagai larutan untuk pewarnaan HE yang diperoleh dari Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

D. Alat dan Instrument Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : Mesin penyerbuk Retsch, oven Memmert, ayakan dengan nomor mesh 40, timbangan analitik OHAUSS, maserator, waterbath, hot plate, evaporator BUCHI, aluminium foil, moisture balance HG5 Hologen Moisture Analyzer, seperangkat alat gelas berupa Erlenmeyer, beaker gelas, gelas ukur, labu ukur, cawan porselin, pengaduk Pyrex Iwaki Glass, spuit injeksi, spuit injeksi oral, alat sentrifugasi Centurion Scientific, mikropipet, blue tip, yellow tip, tabung efendorf, mikrovitalab Microlab 200, Merck, micro haematocrit tubes, vortex Genie Wilten, timbangan tikus OHAUSS, mortir dan stamper, stopwatch, tabung reaksi, embedding casette, pisau skalpel No 22-24, balok kayu, mikrotom, coverglass, inkubator, tabung film, silet, tissue embedding console, bunsen, cetakan pagoda, balok kayu ukuran 3 cm x 1 cm x 1 cm, mikrotom, panangas, gelas obyek, gelas penutup, staining jar, corong gelas, lap, stop watch, kotak preparat dan mikroskop, magnetic stirer, kertas saring, akuades dalam botol semprot, styrofoam, jarum, mikrotip, label, keranjang preparat dan refrigerator.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman sukun

Determinasi daun sukun Artocarpus altilis Park. Fosberg. mengikuti Bihrmann’s Caudiciforms dan Taxonomy, serta dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan

Daun Artocarpus altilis Park. Fosberg. diperoleh dari desa Sewon, Bantul, Yogyakarta. Daun yang diambil adalah daun segar berwarna hijau, tidak berlubang dan tidak terlalu tua dan muda diambil daun yang berada tidak dipangkal dan diujung batang.

3. Pembuatan simplisia

Pembuatan simplisia daun Artocarpus altilis Park. Fosberg. yang telah dikumpulkan, dicuci dengan air mengalir, kemudian ditiriskan pada sinar matahari, untuk meniadakan air pada daun. Selanjutnya, daun dikeringkan kembali menggunakan oven pada suhu 50 O C selama 24 jam dan diserbuk menggunakan mesin penyerbuk di LPPT Universitas Gadjah Mada. Kemudian serbuk diayak menggunakan ayakan dengan nomor 40 mesh.

4. Pembuatan ekstrak etanol daun Artocarpus altilis Park. Fosberg

Pembuatan ekstrak etanol daun sukun dilakukan dengan cara menyari simplisia daun Artocarpus altilis Park. Fosberg. dengan derajat kehalusan 40 mesh. Serbuk seberat 100 g direndam dengan 75 ml pelarut etanol 96 di dalam erlenmeyer selama 5 hari terlindung dari cahaya dan dilakukan pengadukan setiap hari. Kemudian serbuk diremaserasi lagi dengan 25 ml pelarut etanol 96 selama 2 hari, di tempat sejuk, terlindung dari cahaya dan dilakukan pengadukan setiap hari. Setelah dimaserasi dan diremaserasi, hasil maserasi dan remaserasi disaring dengan kertas saring. Hasil saringan kemudian dievaporasi dengan evaporator pada suhu 50ºC, kemudian dipindahkan ke cawan porselin yang telah ditimbang sebelumnya, dengan maksud untuk mempermudah perhitungan rendemen ekstrak kental yang akan diperoleh. Selanjutnya, ekstrak kental didalam cawan porselin diuapkan di waterbath dengan suhu 50 o C kemudian dimasukkan dalam oven untuk diuapkan dengan suhu 50 o C agar mendapatkan ekstrak etanol daun sukun dengan bobot ekstrak yang tetap.

5. Penetapan kadar air serbuk daun Artocarpus altilis Park. Fosberg.

Penetapan kadar dilakukan dengan cara susut pengeringan. Sebanyak 5,0 g serbuk daun Artocarpus altilis ditimbang dan kemudian serbuk dimasukkan ke dalam alat moisture balance pada suhu 105º C selama 15 menit dan kemudian dilakukan perhitungan kadar air berdasarkan selisih bobot sebelum dimasukkan ke dalam alat moisture balance. Selisih tersebut merupakan kadar air serbuk yang diteliti. 6. Dosis ekstrak etanol Artocarpus altilis Park. Fosberg. pada penelitian Dosis ekstrak etanol Artocarpus altilis Park. Fosberg. yang digunakan adalah 50 mgkgBB. Dosis ini mampu memberikan efek hipoglikemik pada tikus dengan pemberian ekstrak air panas daun Artocarpus heterophyllus yang mempunyai famili yang sama Artocarpus altilis Park. Fosberg. famili Moraceae Chandrika et al, 2006.

7. Pembuatan suspensi CMC Na 0,5

Serbuk CMC ditimbang sebanyak 0,5 g, kemudian dilarutkan dengan akuades yang telah dipanaskan sebelumnya. Diaduk sambil dipanaskan di atas hot plate hingga semua serbuk larut, kemudian ad 100 ml dengan akuades.

8. Pembuatan dapar Na Sitrat 50 mM pH 4,5

Na sitrat ditimbang sejumlah 14,705 g, kemudian ditambahkan akuades hingga 1 liter. Ditimbang juga asam sitrat 10,507 g ditambahkan akuades ad 1 liter. Dilakukan proses titrasi Na sitrat dengan menggunakan asam sitrat hingga diperoleh pH 4,5 yang diukur dengan menggunakan pH-meter. a. Asam sitrat 50 mM = 0,05 molar Molar = 0,05 molar 1 liter Mr asam sitrat = 210,14 Asam sitrat = 10,507 g dalam 1 liter b. Na sitrat 50 mM = 0,05 molar Molar = 0,05 molar 1 liter Mr Na sitrat = 294,1 Na sitrat = 14,705 g dalam 1 liter

9. Penetapan dosis streptozotosin

Dosis STZ yang digunakan adalah dosis yang mampu meningkatkan kadar glukosa darah tikus Sparague Dawley jantan berdasarkan penelitian sebelumnya oleh Astuti, dkk. 2001, yaitu sebesar 40 mgkgBB.

10. Induksi hiperglikemia pada tikus

Tikus dikatakan hiperglikemia jika kadar glukosa darah ≥ 200 mgdL. Pada hari ke-0, kadar glukosa darah diukur dengan metode GOD-PAP, kemudian tikus kelompok positif pankreotoksik pada hari ke-1 diinduksi dengan STZ dosis 40 mgkgBB single dose yang sebelumnya telah dilarutkan dengan buffer Na sitrat pH 4,5 dan diinjeksi secara intraperitonial. Kelompok perlakuan diinduksi STZ dosis 40 mgkgBB pada hari ke-1 dan dilanjutkan dengan memberikan ekstrak etanol Artocarpus altilis Park Fosberg dosis 50 mgkgBB hingga hari ke-7. Hari ke-0, 4 dan 7 kadar glukosa darah diukur dengan menggunakan metode GOD-PAP. 11. Pengukuran kadar glukosa darah a. Pembuatan serum. Darah tikus diambil melalui sinus orbitalis mata pada mata dan ditampung dalam tabung efendrof, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit dan diambil serumnya. b. Pengukuran kadar glukosa. Alat yang digunakan dalam mennganalisis kadar glukosa darah adalah mikrovitalab. Kadar glukosa dinyatakan dalam mgdl. Pengukuran kadar glukosa serum dilakukan di Laboratorium Anatomi Fisiologi Manusia - Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Analisis dilakukan dengan mencampurkan bahan seperti pada tabel III., kemudian divortex dan dibaca serapannya setelah didiamkan selama 20 menit operating time pada suhu 20-25ºC. Tabel III. Volume bahan untuk pengukuran kadar glukosa Bahan Volume µL Aquabidest Larutan baku glukosa Supernatan Pereksi GOD-PAP Blanko 10 - - 1000 Standart - 10 - 1000 Sampel - - 10 1000

12. Desain dan perlakuan penelitian

Penelitian akan dilakukan dengan menggunakan 16 ekor tikus jantan Wistar yang dibagi ke dalam 4 kelompok perlakuan.

a. Kelompok I Basal

Hari ke-0, dan 4 tikus diukur kadar glukosa darah dan berat badannya. Tikus tidak diberi perlakukan apapun hingga hari ke-7, kemudian hari ke- 7, tikus diukur kembali kadar glukosa darah dan berat badan.

b. Kelompok II Kontrol Pankreotoksik

Hari ke-0 tikus diukur kadar glukosa darah dan berat badan, kemudian hari ke-1 diinduksi STZ 40 mgkgBB i.p. Tikus tidak diberi terapi, kemudian hari ke-4, dan 7 diukur kembali kadar glukosa darah dan berat badan.

c. Kelompok III Negatif

Hari ke-0 tikus diukur kadar glukosa darah dan berat badan, kemudian hari ke-1 diberi CMC Na dengan dosis 50 mgkgBB. Tikus tidak diinduksi streptozotosin, kemudian hari ke-4 dan 7 diukur kembali kadar glukosa darah dan berat badan.

d. Kelompok IV Perlakuan

Hari ke-0, tikus diukur kadar glukosa darah dan berat badan yang tiga hari sebelumnya diberikan ekstrak daun Artocarpus altilis Park. Fosberg. 50 mgkgBB p.o., kemudian hari ke-1 diinduksi streptozotosin 40 mgkgBB i.p. dan hari ke-1 hingga hari ke-7 diberikan ekstrak etanol daun Artocarpus altilis Park. Fosberg. 50 mgkgBB p.o. Kemudian hari ke-4 dan 7. Hari Tikus diukur kembali kadar glukosa darah dan berat badannya.

13. Pengumpulan sampel

Tikus yang akan digunakan untuk penelitian, diukur berat badannya sebelum diukur kadar glukosa darahnya. Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata pada mata, diambil darahnya dan diukur menggunakan mikrovitalab dengan metode enzimatik GOD-PAP hari ke-0 , 4 dan 7. Pada hari ke-14, tikus di bedah dan diambil pankreasnya untuk di amati gambaran histologi pankreas tikus.

14. Pembuatan slide histologi pankreas

a. Trimming

Trimming dilakukan setelah proses fikasasi dengan melakukan pemotongan jaringan setebal kurang lebih 4 mm dengan orientasi sesuai dengan organ yang akan dipotong.setelah dilakukan pemotongan jaringan diletakkan dalam embedding cassette.

b. Dehidration

Dehidrasi jaringan dilakukan menggunakan “tissue processor” untuk mengeluarkan air yang terkandung dalam jaringan, dengan menggunakan cairan dehidran alkohol 80, 95, dan alkohol absolut. Cairan dehidran ini kemudian dibersihkan dari dalam jaringan dengan menggunakan reagen pembersih clearing agent dengan menggunkan xylol. Reagen pembersih kemudian diganti dengan parafin dengan cara penetrasi ke dalam jaringan, proses ini disebut impregnasi.

c. Embedding

Setelah proses dehidrasi, jaringan yang ada di dalam embedding cassette dipindah ke dalam base mold. Kemudian diisi dengan parafin cair dan diletakkan pada blok kayu ukuran 3x3 cm atau pada embedding cassette. Jaringan yang sudah dilekatkan pada balok kayi atau cassette disebut blok. Fungsi dari balok kayu atau cassette adalah untuk pemegang pada saat blok dipotong pada mikrotom.

d. Cutting

Cutting adalah pemotongan jaringan yang sudah didehidrasi dengan menggunakan mikrotom. Metode : 1. Orientasi blok pada mikrotom Blok diletakkan sejajar memanjang dengan pisau. Jaringan yang keras harus diletakkan di bagian atas. Kemudian sediakan cukup ruangan antara jaringan dengan tepi blok untuk memudahkan pemisahan jaringan. Hasil pemotongan yang rata dan tidak berkerut menandakan ketajaman pisau yag digunakan. 2. Soaking Jaringan dilembabkan dengan menempelkan kapas basah pada permukaan blok.untuk menjaga agara suhu blok dan suhu pisau tetap sama, masing-masing didinginkan dengan air es. 3. Mengambangkan lembaran potongan jaringan Lembaran jaringan diapungkan dengan meletakkan salah satu ujung potongan di atas permukaan air dalam waterbath. Kemudian untuk menghilangkan kerutan jaringan dapat dilakukan dengan cara menekan salah satu sisi dari potongan jaringan dengan ujung jari dan sisi lain ditarik dengan menggunakan kuas kecil. 4. Pemisahan rangkaian lembaran jaringan Dilakukan dengan menggunakan “pemisah jaringan” yang dipanaskan kemudian dilakukan pemisahan rangkaian lembaran jaringan ribbon 5. Pengambilan ribbon dengan slide Lembaran jaringan diambil dengan cara memasukkan slide bersih secara diagonal ke dalam waterbath. Spesimen jaringan diletakkan tepat di tengah slide. Dicegah agar jangan sampai ada gelembung udara di bawah jaringan.

e. Stainingpewarnaan

Proses pewarnaan jaringan pankreas ini menggunakan teknik pewarnaan HE.

f. Mounting

Setelah jaringan pada slide diwarnai, dilakukan “mounting” dengan cara meneteskan bahan mounting DPX, Entelan, Canada balsam sesuai kebutuhan dan ditutup dengan coverglass, cegah jangan sampai terbentuk gelembung udara. Kemudian slide yang sudah jadi, diamati di bawah mikrokop sinar.

F. Analisis Hasil

Pengukuran kadar glukosa darah dan berat badan melalui perhitungan mean ± SD, yang mana kadar glukosa darah normal pada tikus yaitu 50-135 mgdl, apabila kadar glukosa darah melebihi batas normal maka tikus mengalami hiperglikemia Delaney, 2008. Setelah itu, dilanjutkan dengan analisis histologi pankreas secara kualitatif. Gambar 5. Skema Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Artocarpus altilis Park. Fosberg Hari ke-0 Tikus 16 ekor diambil darahnya pada daerah sinus orbitalis mata tikus, diukur KGD dengan metode GOD-PAP dan ditimbang berat badannya Hari ke-1 Tikus 4 ekor kelompok basal tidak diberikan apapun Tikus 4 ekor kelompok kontrol negatif diberi CMC Na 0,5 p.o Tikus 4 ekor kelompok kontrol pankreotoksik diinduksi STZ 40mgkgBB i.p Single dose Tikus 4 ekor kelompok perlakuan diberikan ekstrak etanol daun sukun p.o dan diinduksi STZ 40 mgkgBB i.p single dose. Hari ke-4 16 ekor tikus diambil darahnya pada daerah sinus orbitalis mata, kemudian diukur KGD dengan metode GOD-PAP, dan ditimbang berta badannya Hari ke-7 Tikus 16 ekor diambil darahnya pada sinus orbitalis mata, diukur KGDP dan ditimbang berat badannya Hari ke-14 Tikus 16 ekor dibedah dan diambil organ pankreasnya Perhitungan hasil Kelompok basal Kelompok kontrol negatif Kelompok kontrol pankreotoksik Kelompok perlakuan EEA Ekstrak EEA 50 mgkgBB p.o Akuades p.o CMC Na 0.5 p.o Akuades p.o Hari ke-2 hingga ke-7 Selama 3 hari sebelum diinduksi streptozotosin pada kelompok perlakuan diberikan ekstrak etanol daun Artocarpus altilis Park. Fosberg 50 mgkgBB p.o 40

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas penurunan kadar glukosa darah ekstrak etanol daun Artocarpus altilis Park. Fosberg dosis 50 mgkgBB pada tikus jantan galur Wistar terinduksi streptozotosin dosis 40 mgkgBB dengan melihat Kadar Glukosa Darah KGD, berat badan dan gambaran histologis pankreas.

A. Hasil determinasi serbuk daun sukun Artocarpus altilis Park. Fosberg

Determinasi serbuk daun Artocarpus altilis Park. Fosberg. dilakukan dengan tujuan untuk memastikan bahwa serbuk daun sukun yang digunakan adalah benar serbuk daun sukun. Determinasi dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada. Hasil determinasi membuktikan bahwa benar serbuk daun sukun yang digunakan dalam penelitian adalah serbuk daun Artocarpus altilis Park. Fosberg. Hasil determinasi tertera dalam lampiran 2.

B. Penetapan kadar air serbuk daun sukun Artocarpus altilis Park. Fosberg

Penetapan kadar air daun Artocarpus altilis Park. Fosberg. bertujuan untuk memastikan kadar air yang terkandung dalam daun Artocarpus altilis Park. Fosberg. yang digunakan dalam penelitian memenuhi salah satu persyaratan serbuk yang baik. Serbuk yang baik mengandung kadar air kurang dari 10 Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995. Penetapan kadar air dilakukan di Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Metode yang