Ekstraksi dan Identifikasi Fungi Mikoriza Arbuskula

3.3. Pelaksanaan Penelitian

Sebelum pengambilan sampel pertama sekali yang perlu dilakukan adalah penetapan areal pengambilan sampel, kemudian dilanjutkan dengan pembuatan jalur. Jalur dibuat sepanjang 200 m dengan lebar 5 m dari garis pantai menuju ke daratan. Jalur dibagi dalam 10 petak dengan ukuran panjang setiap petak 20 m dan lebar 5 m. Jumlah jalur yang dibuat sebanyak 3 jalur dengan jarak antar jalur sekitar 200 m. Teknik pengambilan sampel tanah dan akar disajikan pada Lampiran 1. Teknik pengambilan sampel tanah dan akar ini mengacu pada metode Kim dan Weber 1985 dan Ragupathy dan Mahadevan 1991, yaitu metoda jalur atas dasar gradien salinitas. Pada masing-masing petak dalam jalur diambil sampel tanah sebanyak 600–700 g dari zona rizosfir, yaitu pada kedalaman 0–20 cm. Selain itu juga diambil 3 jenis anakan yang dominan pada setiap petak ukur untuk mempelajari kolonisasi FMA pada setiap petak ukur. Dari sampel tanah yang diambil juga dilakukan analisa kimia untuk mengetahui tingkat salinitas tanah dan beberapa sifat kimia contoh tanah, diantaranya N, P, pH dan C organik.

3.3.1. Ekstraksi dan Identifikasi Fungi Mikoriza Arbuskula

Ekstraksi spora FMA dilakukan untuk memisahkan spora FMA dari sampel tanah sehingga dapat dilakukan identifikasi FMA guna mengetahui jumlah dan genus spora FMA yang terdapat pada setiap petak sampel. Teknik yang digunakan dalam mengekstraksi spora FMA adalah teknik tuang–saring dari Pacioni 1992 dan akan dilanjutkan dengan teknik sentrifugasi dari Brundrett et al. 1996. Prosedur kerja teknik tuang–saring adalah sebagai berikut: pertama mencampurkan tanah sampel sebanyak 50 g dengan 200–300 ml air dan diaduk sampai butiran-butiran tanah hancur. Kemudian Universitas Sumatera Utara disaring dalam satu set saringan dengan ukuran 710 µm, 425 µm, 125 µm dan 45 µm secara berurutan dari atas ke bawah. Dari saringan bagian atas disemprot dengan air kran untuk memudahkan bahan saringan lolos. Kemudian saringan paling atas dilepas dan saringan kedua kembali disemprot dengan air kran. Setelah saringan kedua dilepas sejumlah tanah sisa yang tertinggal pada saringan terbawah dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse. Hasil saringan dalam tabung sentrifuse ditambahkan dengan glukosa 60 yang diletakkan pada bagian bawah dari larutan tanah dengan menggunakan pipet. Tabung sentrifuse ditutup rapat dan disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 3 menit. Selanjutnya cairan pada tabung sentrifuse dituang ke dalam saringan 45 µm dan diusahakan supernatannya tidak ikut, lalu dicuci dengan air mengalir air kran untuk menghilangkan glukosa. Endapan yang tersisa dalam saringan di atas dituangkan ke dalam cawan petri dan kemudian diamati di bawah mikroskop binokuler untuk penghitungan kepadatan spora dan pembuatan preparat guna identifikasi spora FMA yang ada. Bahan pewarna Melzer’s dan pengawet PVLG yang digunakan sebagai pembuat preparat spora diletakkan secara terpisah pada satu kaca preparat. Spora-spora FMA yang diperoleh dari ekstraksi setelah dihitung jumlah diletakkan dalam larutan Melzer’s dan PVLG dan jenis spora FMA yang ada di kedua larutan ini sama. Selanjutnya spora-spora tersebut dipecahkan secara hati-hati dengan cara menekan kaca penutup preparat menggunakan ujung lidi. Perubahan warna spora dalam larutan Melzer’s adalah salah satu indikator untuk menentukan tipe spora yang ada. Secara skematis alur kerja dalam ekstraksi dan identifikasi spora FMA disajikan pada lampiran 2 Universitas Sumatera Utara

3.3.2. Kolonisasi FMA pada Akar Tanaman Sampel