UIN Syarif Hidayatullah
diamati di spektrofotometri UV-VIS yang diukur pada panjang gelombang 225 nm.
2.6 Spektorfotometri Ultraviolet
Spekrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar spektrum dengan
panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi, spektrofotometer digunakan untuk
mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi panjang gelombang Khopkar, 2008. Bila cahaya
monokromatik maupun campuran jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk akan dipantulkan sebagian diserafp dalam medium itu, dan
sisanya diteruskan Basset, dkk., 1994. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan
visual, yang dengan studi lebih mendalam dari absorpsi energi radiasi oleh macam-macam zat kimia sehingga dilakukannya pengukuran ciri-ciri serta
kuantitatifnya dengan ketelitian yang lebih besar Day dan Underwood, 1983. Dalam aspek kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan larutan
sampel dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang
diteruskan dengan intensitas sinar yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya Sudjaji dan Rohman, 2007.
Pengukuran serapan cahaya oleh larutan molekul diatur dengan hukum Lambert- Beer, yang ditulis sebagai berikut:
Log I It = A = ε bc
Dengan I adalah intensitas radiasi yang masuk, It adalah intensitas radiasi
yang ditransmisikan, A dikenal sebagai absorbans dan merupakan ukuran jumlah cahaya yang diserap oleh sampel, ε adalah tetapan yang dikenal sebagai koefisien
ekstingsi molar dan merupakan absorbans larutan 1 M analit tersebut, b adalah panjang jalur sel dalam cm, biasanya 1 cm, dan c adalah konsentrasi analit dalam
mol per liter Watson, 2010.
UIN Syarif Hidayatullah
Dalam produk farmasi, konsentrasi dan jumlah biasanya dinyatakan dalam gram atau miligram dan bukan dalam mol sehingga untuk keperluan analisis
produk ini, hukum Lambert-Beer ditulis dalam bentuk berikut ini: A = A 1, 1cm bc
A adalah absorbans yang diukur, A 1, 1cm adalah absorbans larutan 1 bv g100 ml dalam satu sel berukuran 1 cm, b adalah panjang jalur dalam
cm, dan c adalah konsentrasi sampel dalam g100 ml. Karena pengukuran biasanya dibuat dalam sel berukuran 1 cm Watson, 2010.
2.7 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau sering disebut dengan HPLC High Performance Liuid Chromatography dikembangkan pada akhir
tahun 1960-an dan pada awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas dan paling cepat berkembang untuk analisis
dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel. Kegunaan umum KCKT adalah untuk: pemisahan sejumlah senyawa
organik, anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian impurities; analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap non-volatil;
penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama;
pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit trace elements, dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang
tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif Gandjar Rohman, 2007 ; Harmita, 2006.
2.7.1 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik dimana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair secara sukses terhadap suatu
masalah yang dihadapi membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter
kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel.
UIN Syarif Hidayatullah
Pada dasarnya, instrumentasi KCKT terdiri atas delapan komponen pokok, yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukkan
sampel, kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung
penghubung, dan suatu komputer atau integrator atau perekam Gandjar
Rohman, 2007.
2.7.2 Komponen KCKT 2.7.2.1 Pompa
Pompa atau sistem penghantaran fase gerak pada KCKT bertujuan untuk menjamin berlangsungnya proses penghantaran fase gerak secara tepat,
reprodusibel, konstan dan bebas dari gangguan. Pompa yang digunakan untuk KCKT harus memenuhi syarat sebagaimana syarat wadah pelarut, yaitu pompa
harus inert terhadap fase gerak. Bahan pompa ang digunakan harus terbuat dari bahan yang tahan terhadap eluen, seperti gelas, baja tahan karat, teflon dan batu
nilam Gandjar Rohman, 2007.
2.7.2.2 Injektor
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom kepala kolom dengan cara diinjeksikan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir
dibawah tekanan tertentu menuju kolom dengan menggunakan suntikkan yang terbuat dari bahan tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan
keluk sampel sample loop internal dan eksternal. Diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom Gandjar Rohman, 2007 :
Johnson Stevenson, 1991.
2.7.2.3 Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf yang berfungsi untuk memisahkan masing-masing komponen. Untuk menahan tekanan tinggi, kolom dibuat dari
bahan yang kokoh seperti stainless steel atau campuran logam dengan gelas Gandjar Rohman, 2007.
UIN Syarif Hidayatullah
2.7.2.4 Detektor
Detektor berfungsi untuk mendeteksi atau mengidentifikasi adanya komponen cuplikan yang ada dalam eluat dan mengukur jumlahnya. Detektor
pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan selektif seperti
detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti
UV-Vis, detektor fluoresensi dan elektrokimia Gandjar Rohman, 2007 : Harmita, 2006.
2.7.2.5 Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam inert. Adah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Sebelum digunakan, fase gerak ini harus dilakukan degassing penghilangan gas, karena
adanya gas pada fase gerak akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Sedangkan adanya
partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung
tersebut. Oleh karena itu, fase gerak sebelum digunakan harus dsaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil tersebut Gandjar Rohman,
2007.
2.7.2.6 Fase Gerak
Fase gerak merupakan suatu peubah yang dapat mempengaruhi proses
pemisahan dalam sistem KCKT. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas
campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal fase diam lebih polar daripada fase gerak, kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik fase diam kurang polar daripada fase gerak, kemampuan elusi menurun dengan
UIN Syarif Hidayatullah
meningkatnya polaritas pelarut Gandjar Rohman, 2007 : Johnson Stevenson,
1991.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik Gandjar
Rohman, 2007.
2.8 Metode Validasi
Validasi metode analisis menurut United States Pharmacopeia USP dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis yang dilakukan akurat, spesifik,
reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis.
2.8.1 Akurasi
Akurasi adalah kedekatan hasil penetapan yang diperoleh dengan hasil sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai hasil perolehan kembali dari analit yang
ditambahkan. Untuk pengujian senyawa obat, akurasi diperoleh dengan membandingkan hasil rujukan dengan bahan rujukan standar. Syarat akurasi yang
baik yaitu 98-102. ℎ
� = ℎ �
� � ���ℎ �
Harmita, 2006 : JohnsonStevenson, 1991.
2.8.2 Linearitas
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transportasi matematik yang baik,
proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat
ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan dan linearitas yang dapat diterima. Dalam prakteknya, digunakan satu seri larutan yang berbeda
konsentrasinya antara 50-150 kadar analit dalam sampel. Didalam pustaka,
Kategori