pengurangan berat antara dua penimbangan berturut-turut lebih kecil dari 0,001 g. Kadar air dihitung dari pengurangan yang didapat
Depkes, 2000.
d. Uji Jarak Lebur
Menempatkan sejumlah katekin ke dalam tabung kapiler lalu dipanaskan dalam tangas udara atau tangas cair kemudian suhu
dicatat pada saat zat melebur dan pada saat semua dimana semua zat melebur. Dengan demikian jarak lebur dicatat sebagai jarak antara
suhu permulaan dan suhu akhir peleburan yang sempurna. Laju pemanasan alat diatur sekitar 10
o
C per menit, ketika mencapai suhu 165-170
o
C diatur kembali hingga kenaikannya sekitar 1
o
C per menit DepKes, 1979. Jarak lebur katekin pada literatur ialah 175-177
o
C WHO, 1998.
e. Rendemen Katekin
Rendemen katekin dihitung dengan membandingkan berat awal serbuk dengan berat akhir katekin yang dihasilkan.
Rendemen = kemurnian x Bobot serbuk katekin
Bobot serbuk gambir di ekstraksi
3.3.7. Sterilisasi Alat
Bahan-bahan seperti media kultur dan reagen-reagen harus dalam keadaan steril. Sterilisasi dilakukan secara aseptis di dalam
LAFLaminar Air Flow dengan metode filtrasi karena mengandung komponenyang tidak tahan pemanasan. Sterilisasi ini bertujian untuk
menghindariterjadinya kontaminasi dari bakteri atau pengotor lain
seperti debu yangakan merusak validitas hasil penelitian. Filter yang umumnya digunakanadalah filter MF-Milipore tipe GS dengan ukuran
pori 0,2 µm. Alat
–alat gelas yang akan digunakan dicuci bersih kemudiandikeringkan, selanjutnya dibungkus dengan kertas dan
disterilkan dalamautoklaf pada suhu 121
o
C, tekanan 15 lb, selama 15 menit.
3.3.8 Pembuatan Reagen a. Pembuatan Medium DMEM berserum
Sebanyak 500 ml medium DMEM berserum ditambahkan 50ml FBS 10 dan penstrep Penisilin-Streptomisin sebanyak 5
ml, kemudian dihomogenkan. Selanjutnya larutan medium DMEM berserum disaring dengan syringe filter 0.2 µm membrane non
pyrogenic dan disimpan pada suhu -4
o
C
b. Pembuatan Larutan PBS Phosfhat Buffer Saline
Larutan PBS dibuat dengan cara menimbang dinatrium hydrogen fosfat Na
2
HPO
4
sebanyak 1,081 gram, kemudian ditambahkan 0,106 gram kalium fosfat KH
2
PO
4
; 4,025 gram natrium klorida NaCl, dan 0,102 gram kalium klorida KCl.
Selanjutnya dilarutkan dalam aquadest steril hingga 500 ml. Stabilkan larutan pada pH 7,2 dengan menggunakan pH meter
kemudian disterilkan dengan autoklaf dan disimpan pada suhu kamar.
c. Pembuatan Larutan SDS Sodium Dedocyl Sulfat 10 bv
Menimbang SDS sebanyak 10 gram kemudian dilarutkan dalam 90 mlaquadest steril dan 10 ml HCl 0.01 N, kemudian diaduk
sampai larut.
d. Pembuatan Larutan MTT 3 – [4,5 – dimethylthiazol – 2Yi] – 2,5
– diphenyl tetrazolium bromide
Untuk pengamatan proliferatif sel secara kolorimetri, 5 mg MTT dilarutkan dalam 1 ml PBS dan difilter agar steril. Kemudian
MTT diberikan sebanyak 10 µL per 100 µL medium pada tiap-tiap sumuran Mosmann, 1983.
Pada penelitian ini, Larutan MTT dibuat dengan cara melarutkan serbuk MTT sebanyak 1 gram dalam 40 ml PBS steril.
Tiap sumuran diberi larutan MTT tersebut sebanyak 10 µl.
3.3.9 Persiapan Larutan Uji a. Suspensi Campuran Katekin Gambir Uncara gambier Roxb.
dan Eugenol .
Sebanyak masing-masing 125 mgkatekin dan eugenol ditimbang dan dimasukkan ke dalam mikro tube dan dilarutkan
dalam 5000µl DMSO 99 , sentrifuge sampai homogen. Larutan ini dijadikan larutaninduk dengan konsentrasi 50000 µgmL larutan
induk 1, diambil 50 μl laluditambahkan media DMEM sebanyak 450 µl untukmemperoleh larutan dengan konsentrasi 5000 µgmL
larutan induk 2, kemudian larutan uji dengan seri 3.125; 6.25;
17.5; 25; 50; 100; dan 200 µgmL dibuat dengan mengencerkan beberapa μl dari larutan induk 2.
b. Kontrol Cisplatin
Sediaan cisplatin 10 mg20 ml 500 µgmL sebagai larutan indukdimasukkan dalam mikrotube, kemudian dibuat pengenceran
denganmemipet beberapa μl dari larutan induk, agar diperoleh lima konsentrasiyaitu 1.5, 3, 4.5, 6, 7.5, dan 9 µgmL.
c. Kontrol DMSO kontrol negatif
DMSO yang digunakan merupakan DMSO pro Analysis.
3.3.10 Persiapan Kultur HeLa Cell Line
a. Aktivasi sel HeLa Thawing Kultur Sel
1. Mengeluarkan tabung yang berisi HeLa cell line dari tangki wadah berisi dry ice bersuhu -80
C , kemudiandicairkan dalam waterbath 37
o
C sampai gumpalan di dalam vial mencair. 2. Didalam LAF, HeLacell line diambil seluruhnya dengan
menggunakan pipet dan dimasukkan ke dalam tabungsentrifuge kemudianditambahkan
7 ml
medium DMEM
kemudiandisentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. 3. Supernatan yangdiperoleh kemudian dipisahkan sedangkan pellet
diresuspensikan denganmenggunakan 5 ml PBS,selanjutnya disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 4000 rpm.
4.Supernatan kemudian dipisahkan dan pellet yang dihasilkan diresuspensi dengan 3 ml DMEM berserum, kemudian
dimasukkan ke dalam T-flaskyang telah berisi 7 ml DMEM
berserum lalu diinkubasi pada suhu 37
o
Cdalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam hingga sel menutupi permukaan cell culture dish dengan tingkat kepadatan 95.
b. Pembuatan dan Pengembangan sel HeLa Subkultivasi
