III. METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT
Bahan baku yang digunakan dalam pembuatan kombucha adalah starter kombu yang diperoleh dari praktisi pembuatan kombucha di daerah
Cipinang Muara Jakarta Timur, teh hitam rajangan cap Botol yang dibuat menjadi seduhan teh, air dan gula pasir sukrosa cap Gulaku. Dalam
penelitian ini digunakan dua jenis bakteri asam laktat berpotensi probiotik yaitu Lactobacillus plantarum pi28a hasil isolasi dari pikel dan Lactobacillus
coryneformis hasil isolasi dari tempoyak yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB koleksi
pribadi Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, MS. Media pertumbuhan dan pengujian BAL adalah MRS de Mann Rogosa Sharp Agar dan Broth yang
ditambah CaCO
3
. Medium EMBA Eosine Methylene Blue Agar untuk analisa bakteri koliform dan VJA Vogel Johnson Agar untuk analisa
stafilokoki. Bahan-bahan lainnya yaitu susu skim, glukosa, alkohol, akuades, spiritus, NaCl, dan NaOH.
Alat-alat yang digunakan adalah lemari es, oven, autoklaf, inkubator, neraca analitik, mikroskop, hot plate, pHmeter, vortex, toples kaca, alat-alat
gelas, cawan petri, kain kasa, bunsen, sendok, dan ose.
B. METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu 1 Pembuatan kombucha probiotik, 2 Aktivitas antibakteri kombucha probiotik terhadap
bakteri patogen Challenge Test, dan 3 Studi penyimpanan.
1. Pembuatan Kombucha Probiotik
a. Persiapan Kultur BAL Sebelum tahap pembuatan kombucha terlebih dahulu dilakukan
persiapan kultur BAL. Pertama kali dilakukan pengamatan di bawah
19
mikroskop untuk memastikan kultur yang digunakan adalah BAL dengan menggunakan metode pewarnaan Gram.
Kultur yang telah diawetkan dalam bentuk manik-manik dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 7 ml MRSB sebanyak 3-5 buah
manik-manik. Selanjutnya dari kultur induk ini diambil sebanyak 5 ml dan dimasukkan kembali ke dalam MRSB 7 ml, lalu diinkubasi pada suhu
37
o
C selama 2 hari. Setelah 2 hari, dari kultur tersebut dipipet sebanyak 5 ke dalam campuran susu skim 10 dan glukosa 3 , kultur ini
dinamakan kultur kerja. Setelah 2 hari inkubasi, kultur kerja ini telah siap diinokulasikan ke dalam produk.
b. Pembuatan kombucha probiotik Pada tahap ini dipelajari beberapa faktor yang berperan seperti
pengaruh konsentrasi teh hitam, susu skim dan proses sterilisasi. Hal ini dilakukan agar dihasilkan kombucha dengan rasa, aroma dan pertumbuhan
BAL yang maksimal. Modifikasi konsentrasi teh hitam yang digunakan adalah 12 g teh hitam dan 9 g teh hitam dalam 1 liter air mendidih.
Pembuatan kombucha dilakukan sesuai prosedur dari Naland 2004. Pertama kali direbus 1 L air hingga mendidih, lalu ditambahkan 4
bungkus teh celup atau 4-8 sendok teh teh hitam rajangan. Teh dibiarkan mengembang selama 15 menit, kemudian disaring. Selanjutnya
ditambahkan 70-100 g gula pasir dan didinginkan sampai suhunya mencapai 20-25
o
C. Setelah dingin, larutan teh dimasukkan ke dalam wadah kaca bersamaan dengan 1 lembar starter kombu. Wadah kemudian
ditutup dengan kain bersih lalu difermentasi selama 7-10 hari pada suhu 23-27
o
C. Jika larutan teh sudah mencapai tingkat keasaman yang benar pH 2.5-3.5, starter kombu diangkat dan larutan kombucha siap untuk
dikonsumsi. Kombucha yang dihasilkan kemudian diinokulasi dengan kedua
jenis BAL yang berbeda. Konsentrasi kultur starter yang diinokulasikan ke dalam produk adalah sebesar 10 . Terdapat dua jenis kultur BAL yang
20
diinokulasikan yaitu L. plantarum pi28a dan L. coryneformis dengan dua jenis cara penambahan dengan susu skim dan tanpa susu skim.
Komposisi media terdiri dari susu skim 10, glukosa 3 dan kultur BAL stok 5. Selanjutnya diinkubasi selama 2 hari dan jumlah BAL dihitung
dengan menggunakan metode penaburan, pengukuran juga dilakukan terhadap nilai pH, total asam tertitrasi TAT, kadar gula
o
Brix dan organoleptik. Proses formulasi pembuatan Kombucha probiotik dapat
dilihat pada Gambar 2.
2 . Aktivitas Antibakteri Kombucha Probiotik Terhadap Bakteri Patogen
Challenge Test
Kombucha yang telah ditambahkan kultur starter BAL 10
8
CFUml diuji aktivitasnya terhadap bakteri uji Escherichia coli dan Staphylococcus aureus konsentrasi 10
5
– 10
6
CFUml selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Selanjutnya jumlah BAL dan bakteri uji dihitung menggunakan metode SPC Standard Plate Count. Kombucha dengan
jenis BAL yang mampu mereduksi jumlah bakteri uji terbanyak, dipilih untuk digunakan pada penelitian tahap selanjutnya. Sebagai kontrol
digunakan kombucha tanpa penambahan BAL.
3. Studi Penyimpanan Kombucha Probiotik
Kategori