Waktu dan Tempat Penelitian Alat dan Bahan Skema Penelitian

23

BAB III METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian berlangsung mulai dari bulan Maret sampai dengan Mei 2011. Tempat penelitian dilakukan yaitu, di Badan Tenaga Nuklir Nasional BATAN Pasar Jum’at, Lebak Bulus, Jakarta Selatan dan Laboratorium Pangan Pusat Laboratorium Terpadu UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2. Alat dan Bahan

Alat-alat utama yang digunakan adalah kromatografi gas - spektrometer massa GCMS Shimadzu QP 2010, Laminar Air Flow Cabinet LAFC, spektrofotometer UV-Vis Spectronic Genesys 2, spektrometer Fourier Transform Infra Red FTIR, mikroskop berkamera Nikon, timbangan analitik, autoklaf, refrigerator, shaking inkubator, pH meter dan saringan berukuran 100 mesh. Bahan–bahan yang digunakan adalah batubara jenis lignit dengan ukuran 100 mesh yang berasal dari Sumatera Selatan, Minimal Salt Solution MSS 1 g NH 4 2 SO 4 , 0,52 g MgSO 4 .7H 2 O, 5 g KH 2 PO 4 , 0,005 g FeSO 4 , 0,003 g ZnSO 4 .7H 2 O dan 0,003 g MnCl 2 lalu ditambah akuades hingga volumenya mencapai 1000 ml , Potato Dextrose Agar PDA, Trypticase Soy Broth TSB agar bakto, sukrosa, ekstrak ragi, aseton, KH 2 PO 4 , alumunium foil, akuades, alkohol 70, larutan fisiologis NaCl 0,85, alkohol 96, lugol, crystal violet, safranin, benzen, heksana, dietil eter, glukosa 0-250 ppm, H 2 SO 4 , K 2 Cr 2 O 7, serbuk KBr kering dan isolat kapang Trichoderma sp. Komposisi media yang 24 digunakan dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Komposisi Media. Konsentrasi dipekatkan 2 kali

3.3. Prosedur Kerja

3.3.1. Persiapan dan Sterilisasi Alat

Alat–alat gelas yang akan digunakan terlebih dahulu dibersihkan, lalu disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C pada tekanan 1 atm selama 15 menit. Peralatan yang tidak tahan panas disterilkan dengan menggunakan alkohol 70 Waluyo, 2008.

3.3.2. Persiapan Serbuk Batubara

Batubara asal Sumatera Selatan digerus dengan mortar secara aseptik di dalam LAFC kemudian disaring menggunakan penyaring dengan ukuran 100 mesh dan diayak. Sampel batubara yang berhasil tersaring ditimbang masing- masing 25 g sebanyak empat kali. Batubara ditempatkan ke dalam petri yang sebelumnya dilapisi alumunium foil. Dua petri berisi batubara yang disterilisasi Nama Media Agar g MSS ml PDA ml TSB ml Ekstra k Ragi g Sukrosa g Serbuk batubar a g Keterangan MSS+ - 500 - - 0,05 0,5 25 Biosolubilisas i PDMA - 500 500 - - - 1 Peremajaan kultur, enumerasi fungi, Kolonisasi TSMA 15 500 - 500 - - 1 Enumerasi bakteri 25 dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 C dan dua petri berikutnya berisi batubara yang dibiarkan tanpa proses sterilisasi.

3.3.3. Pembuatan Media Minimal Salt Solution MSS

Pembuatan media MSS dilakukan dengan cara menimbang bahan seperti 0,52 g MgSO 4 .7H 2 O; 0,003 g ZnSO 4 .7H 2 O; 5 g KH 2 PO 4 ; 0,005 g FeSO 4 ; 1 g NH 4 SO 4 Silva dkk., 2007, ditambahkan 0,003 g MnCl 2 Sugoro dkk., 2011 sebagai modifikasi komposisi media dengan asumsi keberadaan enzim mangan peroksidase setelah itu ditera dengan air akuades hingga 1 liter, kemudian dilarutkan sampai homogen. Media MSS dibuat dalam 2 liter untuk media perlakuan. Media MSS kemudian ditempatkan masing-masing 500 ml ke dalam empat Erlenmeyer berbeda, ditambahkan dengan sukrosa 0,1 0,5 g dan ekstrak ragi 0,01 0,05 g. Campuran dihomogenkan kemudian disterilisasi selama 15 menit dalam suhu 121 C.

3.3.4. Pembuatan Media Potato Dextrose Mineral Agar PDMA

Media PDMA dibuat dengan menimbang PDA sebanyak 39 g dilarutkan dengan akuades 500 ml, media ini dipekatkan dua kali. Dipersiapkan Erlenmeyer yang berbeda untuk dibuat media MSS tanpa sukrosa dan ekstrak ragi sebanyak 500 ml kemudian ditambahkan 0,1 batubara dan dihomogenkan. Media PDA dan MSS tanpa sukrosa dan ekstrak ragi + batubara, disteril di dalam autoklaf selama 15 menit dalam suhu 121 C. Setelah selesai disterilisasi, kedua 26 media itu dicampur dalam satu Erlenmeyer dihomogenkan kemudian dengan segera dituang ke dalam cawan petri steril.

3.3.5. Media Pembuatan Media Trypticase Soy Mineral Agar TSMA

Media TSMA dibuat dengan menimbang sebanyak 30 g Trypticase Soy Broth TSB dan 1,5 dari volume total yaitu 15 g agar dalam 500 ml dengan konsentrasi dipekatkan dua kali. Pada Erlenmeyer berbeda dipersiapkan media MSS tanpa sukrosa dan ekstrak ragi 500 ml ditambah dengan 0,1 batubara dari volume total yaitu 1 g. Kedua media disterilisasi selama 15 menit pada suhu 121 C. Setelah sterilisasi selesai dilakukan pencampuran kedua media menjadi satu, dihomogenkan dan segera dituang ke dalam cawan petri steril.

3.3.6. Pembuatan Kultur Inokulum Spora Trichoderma sp.

Isolat kapang Trichoderma sp. Lampiran 9 diremajakan menggunakan media PDMA dan diinkubasi selama 4-7 hari pada suhu ruang hingga menghasilkan spora. Sebanyak 10 ml NaCl 0,85 steril dimasukkan ke dalam cawan petri berisi isolat kapang, kemudian spora kapang dilepaskan menggunakan ose hingga tampak larut di dalam larutan.

3.3.7. Pengujian Biosolubilisasi Batubara

Media MSS yang telah disterilisasi sebelumnya, ditambahkan 5 batubara disesuaikan dengan perlakuan dapat dilihat pada Tabel 2. Setiap perlakuan terdiri atas dua kali pengulangan duplo. Sebanyak 500 ml masing- 27 masing media ditempatkan ke dalam empat Erlenmeyer berbeda sebagai media perlakuan. Pada perlakuan B dan D ditambahkan kultur inokulum sebanyak 10 10 6 selml vv sedangkan perlakuan A dan C tidak diberi inokulum sebagai kontrol. Kontrol dibedakan pada perlakuan A digunakan batubara steril diautoklaf sedangkan perlakuan C digunakan batubara yang masih mentah. Kemudian semua kultur perlakuan diinkubasi di atas shaking inkubator dengan agitasi 120 rpm, pada suhu ruang selama 28 hari. Pencuplikan sampel kultur dilakukan pada hari ke-0, 2, 7, 14, 21, dan 28. Tabel 2. Kultur Perlakuan Biosolubilisasi Batubara. Perlakuan Batubara steril Batubara mentah Inokulum kapang Trichoderma sp A + - - B + - + C - + - D - + + Keterangan + : Ditambahkan ke dalam komposisi media - : Tidak ditambahkan ke dalam komposisi media Setiap kali dilakukan pencuplikan, sampel kultur dimasukkan ke dalam tube kemudian disaring sebanyak 23 volume menggunakan kertas saring hingga diperoleh supernatan yang sudah terpisah dari endapan batubara. Sisa kultur yang ada di dalam tube digunakan untuk pengukuran pH, pengamatan kolonisasi secara mikroskopis dan enumerasi kapang serta mikroba indigenos. Supernatan yang didapat dimasukan ke dalam yellow tube untuk ditentukan kadar asam humat dan fulvat, solubilisasi batubara menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan GCMS. 28 Endapan produk dari supernatan dikeringkan di dalam oven dengan suhu 55 C untuk analisa gugus fungsi menggunakan FTIR.

3.3.8. Pengukuran pH Media

Supernatan dari masing-masing perlakuan diukur nilai pH-nya menggunakan pH meter. Pengukuran dilakukan setiap pencuplikan pada hari ke-0, 2, 7, 14, 21 dan 28.

3.3.9. Pengamatan Perubahan Populasi Bakteri dan Fungi

Media PDMA dan TSMA masing-masing dituang ke dalam petri sebanyak 15 ml dibiarkan mengeras. Dilakukan pengenceran pada sampel pada tiap pencuplikan. Pengenceran disesuaikan dengan lama inkubasi. Semakin lama masa inkubasi kultur maka semakin banyak seri pengenceran yang dilakukan. Setelah itu, larutan dari tiga pengenceran terakhir diinokulasikan pada media PDMA dan TSMA dengan metode sebar. Pada media TSMA enumerasi dilakukan setelah 24 jam masa inkubasi sedangkan pada media PDMA enumerasi dilakukan setelah 4-7 hari masa inkubasi. Total jenis dan total individu yang muncul semua dicatat untuk dilakukan perhitungan jumlah sel. Jenis bakteri dan fungi yang muncul diamati secara makroskopis dengan mencatat ciri-ciri yang tampak sedangkan untuk pengamatan mikroskopis dilakukan dibawah mikroskop. Khusus untuk bakteri dilakukan pewarnaan Gram untuk mengetahui kemurnian dan bentuk sel. 29 Kolonisasi miselia kapang terhadap batubara diamati untuk mengetahui aktifitas biosolubilisasi terutama oleh kapang. Sampel kultur diambil menggunakan pipet bersih diteteskan di atas kaca preparat bersih diberi tanda nama isolat sesuai perlakuan. Diamati di bawah mikroskop kolonisasi yang terjadi dengan perbesaran 400 kali. 3.3.10. Pengukuran Biosolubilisasi Batubara melalui Analisis Senyawa Fenolik dan Aromatik Terkonjugasi serta Perubahan Pola Panjang Gelombang pada 200-600 nm Pengukuran biosolubilisasi dilakukan dengan melakukan analisis senyawa fenolik dan aromatik terkonjugasi. Produk biosolubilisasi supernatan yang diperoleh selama waktu sampling dilakukan pengukuran absorbansi menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 250 dan 450 nm. Perubahan pola panjang gelombang diamati pada kisaran panjang gelombang 200– 600 nm untuk mengetahui perubahan gugus kromofor produk biosolubilisasi batubara. Nilai absorbansi yang tinggi berbanding lurus dengan tingkat solubilisasi batubara yang tinggi pula Selvi dkk., 2007.

3.3.11. Pengukuran Produksi Asam Humat dan Fulvat

Supernatan dari kultur diambil sebanyak 5 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml kemudian ditambahkan K 2 Cr 2 O 7 5 ml diaduk dan ditambahkan 7,5 ml H 2 SO 4 dihomogenkan kembali. Campuran larutan itu dibiarkan beberapa saat hingga dingin, setelah itu ditambahkan air suling kurang lebih 50 ml lalu diaduk dan kembali dibiarkan hingga dingin. Setelah dingin larutan tersebut ditera 30 hingga tanda batasnya, dikocok sampai homogen. Kadar asam humat dan fulvat dalam larutan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 561 nm, dengan menggunakan deret standar glukosa 0-250 ppm Graham, 1948 dan Shnitzer, 1984 dalam Petunjuk teknis analisis kimia tanah, tanaman, air dan pupuk Balai Penelitian Tanah 2009. Analisis Spektrometer FTIR ini dapat digunakan untuk mengkarakterisasi produk biosolubilisasi batubara. Produk biosolubilisasi batubara dianalisis dengan FTIR pada range frekuensi 4000-450 cm -1 . Produk biosolubilisasi supernatan yang akan diuji ditentukan dari nilai biosolubilisasi tertinggi. Produk supernatan yang diperoleh dilakukan dehidrasi penghilangan air menggunakan alkohol 70 dengan perbandingan 3:1 kemudian di masukkan ke dalam oven dengan suhu 55 C hingga cairan menguap dan tersisa residu produk. Residu produk yang akan diuji dicampurkan dengan serbuk KBr kering hingga menyatu menggunakan lumpang dan serbuk campuran produk dimasukkan ke dalam disk holder kemudian direkam dengan alat spektrometer FTIR. Kontrol yang digunakan ekstrak produk batubara mentah dan batubara steril pada hari ke- 0.

3.3.13. Analisis Hasil Biosolubilisasi Batubara dengan Spektrometer GCMS

Supernatan dan pelarut dicampur dengan perbandingan 1:1, pelarut yang digunakan adalah benzene: heksana: dietil eter dengan perbandingan 3:1:1. campuran tersebut dimasukan kedalam tabung reaksi lalu divortex sampai

3.3.12. Analisis Gugus Fungsi Hasil Biosolubilisasi Batubara dengan Spektrometer FTIR

31 bercampur kemudian didiamkan beberapa saat sampai terbentuk fase atas dan bawah, fase atas dipakai untuk mengidentifikasi jenis senyawa dan menentukan kadar hasil solubilisasi batubara dengan menggunakan GCMS selanjutnya dimasukan ke dalam vial untuk dianalisis dengan alat GCMS. Kondisi optimum GCMS yang digunakan sebagai berikut: Tabel 3. Kondisi Optimum GCMS Silva dkk., 2007 Spesifikasi Keterangan Nama kolom Dimethyl polysiloxane Panjang kolom 30 m Diameter kolom 0,25 mm Ketebalan kolom 0,25µm df Jenis kolom Non polar Suhu kolom oven 50 o C Suhu injeksi 280 o C Cara injeksi Split Cara kontrol aliran Kecepatan linear Tekanan 90,7 kPa Total aliran 19,9 mLmenit Aliran kolom 1,54 mLmenit Kecepatan linear 45 cmdetik Jumlah sampel 5 µl Fase diam Sampel batubara cair Fase gerak Gas helium

3.3.14. Analisis Data

Data penelitian ini dianalisis menggunakan Analysis of Variance ANOVA satu arah dan uji lanjutan Duncan p=0,05, dibantu dengan program SPSS 16 serta secara visual data meliputi parameter yang diamati disajikan dalam bentuk kurva menggunakan program Excel 2007. 32

3.4. Skema Penelitian

Analisis sampel - Pengukuran pH media kultur - Perubahan populasi bakteri dan fungi - Analisis senyawa fenolik dan aromatik terkonjugasi - Perubahan pola panjang gelombang 200-600 nm - Produksi asam humat dan fulvat - Karakteristik gugus fungsi hasil biosolubilisasi batubara - Identifikasi senyawa hasil biosolubilisasi dengan GCMS Analisis data Pencuplikan sampel biosolubilisasi pada hari ke - B MSS+ batubara steril 5 + Trichoderma sp. A MSS + batubara steril 5 C MSS + batubara mentah 5 D MSS + batubara mentah 5 + Trichoderma sp. 2 14 21 28 7 Inkubasi pada suhu ruang di atas shaking inkubator dengan agitasi 120 rpm Peremajaan Inokulum spora Isolat kapang Trichoderma sp. Media MSS Batubara Lignit Batubara mentah nonsteril Batubara diautoklaf steril 33

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Perubahan pH Media

Media kultur perlakuan yang diuji dalam proses biosolubilisasi menunjukkan terjadinya perubahan pH selama inkubasi hingga hari ke-28 Gambar 8. Secara statistik uji anova satu arah menunjukkan bahwa media perlakuan mempengaruhi nilai pH media p ≤0,05 Lampiran 6. Pengaruh perlakuan terhadap nilai pH disebabkan adanya kombinasi agen pengsolubilisasi pada masing-masing perlakuan Tabel 2. Hasil uji statistik lanjutan yaitu uji Duncan p=0,05 menunjukkan perlakuan A MSS + batubara steril 5 memiliki nilai pH tertinggi dan berbeda nyata dengan perlakuan lainnya. Perubahan pH pada perlakuan A MSS + batubara steril 5 terjadi akibat adanya proses agitasi. Proses agitasi mengakibatkan terlepasnya sulfur anorganik selama masa inkubasi Wise, 1990. Batubara mengandung sulfur dalam bentuk anorganik dalam bentuk sulfit dan sulfat Speight, 1994. Selain itu, tingginya nilai pH media A MSS + batubara steril 5 Gambar 8 disebabkan tidak diinduksikan kapang Trichoderma sp. Penambahan spora kapang Trichoderma sp. menciptakan kondisi yang lebih asam dibuktikan dengan nilai pH media perlakuan B MSS + batubara steril 5 + Trichoderma sp. menunjukkan nilai pH yang paling rendah Gambar 8.