Persamaan tersebut sering dijadikan sebagai tetapan dissosiasi dari asam bikarbonat, meskipun ambigu akan lebih baik jika mengacu pada tetapan
keasaman karbondioksida tersebut untuk menghitung pH dari larutan CO
2.
E. Metode Penetapan Kadar Parasetamol di Dalam Darah
Parameter farmakokinetika dihitung dari data perubahan kadar obat tak berubah dalam darah atau cairan lainnya yang besarnya dalam satuan mikrogram
µg kebawah relatif sangat kecil, karena itu syarat sensitivitas dan selektivitas metode penting sekali artinya ,disamping ada pula parameter lain seperti
ketepatan, ketelitian dan kesederhanaan metode. Mengingat subyek yang digunakan adalah makhluk hidup yang dengan ukuran tubuh yang tertentu, maka
volume dari sampel biologis yang diperlukan juga yang tidak kalah penting Smith Stewart, 1981.
Terdapat beberapa metode penetapan kadar parasetamol yang dapat digunakan.
1. Metode gas liquid chromatograpy GLC
Metode ini memiliki selektivitas dan sensitivitas yang tinggi Prescott, 1971. Namun memerlukan plasma sebanyak 2 ml ± 4 ml darah utuh sehingga
sulit untuk diterapkan pada hewan kecil seperti tikus mengingat diperlukan beberapa kali pengambilan sampel darah dalam penelitian farmakokinetika.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2. Metode spektrofotometri-diferensial
Metode ini juga sensitif dan selektif namun volume darah yang dibutuhkan juga besar yaitu 5 ml sehingga tidak mungkin dilakukan pada hewan
kecil Knepil cit Donatus,1994
3. Metode oleh Micelli et al. 1979
Berbeda dengan metode-metode di atas , metode ini hanya memerlukan 0,2 ml serum yang kemudian direaksikan dengan larutan ortokresol dan
ammonium hidroksida. Kemudian dibaca dengan spektrofotometer sinar tampak visibel pada panjang gelombang 615 nm. Namun meski sederhana, sensitif dan
teliti namun tidak memperlihatkan selektivitas terhadap metabolit parasetamol.
4. Metode Cafetz
et al.,
Metode Cafetz et al. 1971, pertama kali dimanfaatkan untuk penetapan kadar parasetamol di dalam cairan biologis oleh Glyn Kendal 1975
Dinyatakan bahwa penetapan kadar parasetamol tak berubah dalam darah dengan dasar reaksi diazotasi memiliki selektivitas dan sensitivitas yang tinggi, sederhana
dan tepat. Metode ini tidak terganggu dengan adanya metabolit parasetamol. Modifikasi volume plasma dapat dilakukan dari 2 ml menjadi 0,5 ml dengan
penyesuaian pereaksi, Sriyanto dkk.,1983 sehingga dapat dilakukan pada hewan uji kelinci dengan ketelitian 98,60. Namun pada tikus agaknya tidak bisa
dilakukan mengingat ukuran tubuh dan volume darah yang jauh lebih kecil dibandingkan kelinci.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5. Metode high performance liquid chromatograpy HPLC
Alternatif lain yang digunakan untuk mengatasi kesulitan diatas adalah dengan metode oleh
Howie et al. 1977 yaitu HLPC. Sistem HPLC yang digunakan yaitu kromatografi partisi dengan sistem reverse phase fase terbalik.
Metode ini telah dikembangkan untuk penetapan secara simultan konjugat parasetamol yaitu sulfat, glukoronat, sistein dan asam merkapturat metode A dan
parasetamol tak berubah dalam darah metode B. Kromatografi adalah prosedur pemisahan senyawa campuran
berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi, karena adanya perbedaan koefisien distribusi masing-masing senyawa di antara dua fase yang saling bersinggungan
dan tidak saling campur, yang disebut sebagai fase gerak mobile phase yang berupa zat cair atau zat gas, dan fase diam stationary phase yang berupa zat cair
atau zat padat Noegrohati, 1994. Analisis kualitatif pada HPLC dilakukan dengan cara membandingkan
waktu retensi senyawa murni dengan waktu retensi senyawa yang dimaksud dalam sampel Gritter et al., 1985. Waktu retensi yang menunjukkan identitas
suatu senyawa merupakan selang waktu yang diperlukan senyawa mulai pada saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor Gritter et
al ., 1985. Tiap senyawa memiliki waktu retensi yang spesifik pada kondisi
tertentu seperti kolom, suhu, laju, dan sebagainya sehingga dapat digunakan sebagai salah satu dasar uji kualitatif Noegrahati, 1994. Analisis kuantitatif
dilakukan berdasarkan perbandingan tinggi atau luas puncak kromatogram senyawa sampel terhadap senyawa standar.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Metode A teridiri dari pompa Orilta model AE 10-4; detektor ultaviolet ceccil, model 212, lambda pada 250 nm,10 µl flow cell; pencatat Honey-well
Model 194; integrator Hawlett-Packard Model 3370 A; kolom tabung berlapis baja anti-karat 170 x 4,9 mm dengan oktadesilsilan yang terikat pada silika
spheris, ukuran partikel 10µm, Spherisorb 10-ODS, Phase Separation, Clwyd; injektor septum. Fase gerak asam asetat 1-metanol-etil asetat 90:15:0,1 pada
4,5 MNm
-2
; laju alir 1,6 mlmenit. Sampel urin yang diencerkan hingga 50 kalidengan air terdestilasi bila perlu. Dalam 0,8 ml sampel ditambahkan standar
internal 0,2 ml larutan 4-florofenol 20mgml dalam air. Dicampur dan diinjeksikan 2-4 µl. untuk urin dengan konsentrasi rendah misalnya yang
dikumpulkan setelah beberapa jam pemberian obat pada dosis tercapai standar internal dikurangi hingga 4mgml. Memberikan larutan standar parasetamol dalam
air dengan jumlah tiap seri tidak diketahui. HPLC dengan metode B memakai alat yang sama dengan metode A
dengan kolom 90 x 4,5 mm. Menggunakan fase diam yang sama pula dengan metode A. fase gerak air-asam asetat-etilasetat98:1:1 pada 2,75 MNm
-2
, laju alir 3 mlmenit. Dalam 1 ml plasma yang mengandung 25-500 µgml parasetamol
pada gelas kaca, tambahkan 1 ml larutan asam trikloro asetat TCA 25 ww yang mengandung 4-florofenol 75, menggojog dengan vortek. Protein
diendapkan dengan sentrifugasi dan supernatan jernih diinjeksikan. Untuk sampel yang mengandung parasetamol kurang dari 25 µgml, ditambahkan 100 µgml
larutan yang mengandung 4-florofenol 7mgml dalam larutan TCA 75 ww kedalam 1 ml plasma dan supernatan yang diinjeksikan sampai dengan 25 µl.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Karena dalam penelitian ini yang ditetapkan hanya kadar parasetamol tak berubah dalam darah maka yang digunakan adalah metode B dengan sedikit
modifikasi Wijoyo, 2001 pada flow rate 3 mlmenit menjadi 1 ml menit; jumlah plasma 1 ml menjadi 0,25 ml sehingga dapat diterapkan untuk hewan uji
tikus; dan konsentrasi asam trikloroasetat 25 bv menjadi 10 bv dan tanpa penggunaan 4-florofenol sebagai campuran. Secara umum metode ini memenuhi
parameter senstivitas, selektivitas, ketepatan dan ketelitian serta dapat mengatasi masalah volume cairan biologis darah yang terjadi pada metode-metode yang
lain.
F. LANDASAN TEORI
