terbentuk dikumpulkan dan ditambah 3 ml asam asetat 5 dalam air bebas ion, dikocok. Selanjutnya fase organik yang telah ditambah asam
asetat dan air bebas ion disentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit. Fase organik dipindahkan dan dikeringkan dengan N
2
freezdryer. Residu kering ditambah 5 ml CHCl
3
5 dalam metanol. Selanjutnya dikeringkan dan diaerasi selama 30 menit. Ekstrak didiamkan dalam
pendingin suhu -20
o
C selama 12 jam. Selanjutnya ekstrak dikeringkan dengan N
2
. Residu kering ditambah 2 ml metanol, asetonitril dan NHCl
3
, sebagai fase gerak 48.5 , 48.5 , 3 .
Standar -karoten dicampurkan dalam petroleum eter, dievaporasi dan dicampurkan dengan diklorometan. Konsentrasi standar ditunjukkan
secara spektrofotomketrik menggunakan koefisien ekstensi molar E tem 1 = 2530,. Konsentrasi yang berbeda digunakan untuk analisa HPLC
dan memplot grafik standar. Koefisien korelasi dihitung untuk menaksir kelinieran diantara konsentrasi standar dan puncak area grafik. Sampel
diencerkan untuk diinjeksikan dan pemisahan analisa dihubungkan dengan rata-rata aliran pelarut pada 1.5 ml per menit dengan sensitifitas detektor
AUFS 0.02 dan standar lebar gelombang 450 nm. Konsentrasi -karoten dihitung dengan grafik standar menggunakan rumus :
Luas puncak sampel Kadar -karoten ppm = x konsentrasi standar x FP
Luas puncak standar Keterangan : FP = faktor pengenceran = 4
8. Analisis Total Karoten Metode Spektrofotometer Parker, 1992
Sampel yang sudah halus ditimbang sebanyak 7.0 gram dan diaduk dengan 42 ml akuades. Sebanyak 20 ml suspensi sampel tersebut
ditambahkan 0.1 gram MgCO
3
, 10 ml aseton dan 15 ml heksan, diblender selama 5 menit, kemudian disaring. Filtrat dipindahkan ke labu pemisahan,
sedangkan residu ditambahkan 5 ml aseton dan 10 ml heksan, diblender 5
menit, diekstraksi dan filtrat dipindahkan ke labu pemisahan yang sama. Ekstraksi dilakukan 1-2 kali sampai residu tidak terekstrak lagi.
Filtrat yang terdapat di labu pemisahan, ditambahkan sedikit air. Dikocok dan didiamkan hingga terjadi pemisahan antara aseton-air-residu
di bagian bawah dengan heksan karotenoid di bagian atas. Larutan di bagian bawah dibuang sedangkan ekstrak karoten di bagian atas disaring
dengan kertas saring anhydrate. Kertas saring tersebut dibilas dengan heksan. Filtrat dipindahkan ke labu takar 100 ml, ditambahkan 22,5 ml
aseton, ditepatkan dengan heksan hingga tanda tera. Hasil ekstraksi dapat disimpan menggunakan botol gelap pada freezer dengan suhu -29
°C. Sebagai faktor koreksi ekstraksi di cari recovery factor yaitu
sampel yang sama ditambahkan -karoten 0,5 mg sebagai larutan standar. Kemudian dilakukan proses ekstraksi seperti pada larutan sampel. Untuk
pengukuran total karoten, sampel dan sampel yang ditambahkan standar diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 453 nm, dengan
blanko yaitu 9 aseton dalam heksan, lalu dibaca absorbennya. Kadar -karoten dengan memperhitungkan recovery factor dihitung dengan
menggunakan rumus : Total karoten ppm = A x D x V x 10 x 100
E
1 1 cm
x M
Keterangan : Recovery factor
A = absorben m
= total karoten sampel ppm D = faktor pengencer
n = total karoten sampel + standar ppm
V = volume ekstrak 100 ml s
= standar yang ditambahkan 0,5 mg E
1 1 cm
= berat sampel g m-n
= a dimana seharusnya a = s
9. Analisis Kadar Total Natrium Metode AAS Apriyantono et al., 1989
Penetapan kadar natrium total dalam penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode AAS. Prinsip dari metode ini adalah residu
sampel yang telah dihilangkan kandungan bahan-bahan organiknya dengan menggunakan pengabuan basah dapat dilarutkan dalam asam
encer. Larutan disebarkan dalam nyala api yang ada dalam nyala AAS sehingga absorpsi atau emisi logam dapat dianalisis dan diukur pada
panjang gelombang tertentu. a. Pereaksi
1. H
2
SO
4
pekat, HNO
3
pekat dan HClO
4
2. Air demineralisasi 3. Larutan stock standar 1000 mgL natrium
4. Larutan standar Encerkan larutan stock standar dengan menggunakan air
demineralisasi sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang bersangkutan seperti dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7. Kondisi yang direkomendasikan untuk analisis logam
Unsur Panjang gelombang
A’’
1
Limit deteksi µg
logam ml
1
Kisaran kerja µg
logamml
1
Sistem nyala
2
Natrium 589.0 0.002
0.1-5 Udara-asetilen
1 Apriyantono et al., 1989 2
AOAC 1995
b. Persiapan sampel dengan pengabuan basah menggunakan H
2
SO
4
, HNO
3
pekat dan HClO
4
Ditimbang tepat sejumlah sampel dan dimasukkan ke dalam Labu Kjeldahl. Ditambahkan 4 ml asam perklorat, beberapa butir batu
didih, dan HNO
3
secukupnya. Ditambahkan pula H
2
SO
4
sambil diaduk perlahan. Dipanaskan perlahan-lahan dengan api kecil selama
5-10 menit sampai timbul asap tebal. Hentikan pemanasan dan biarkan larutan menjadi dingin. Larutan kemudian dipanaskan lagi dengan api
kecil selama 5-10 menit sampai timbul asap H
2
SO
4
putih tebal. Besarkan api dan lanjutkan pemanasan 1-2 menit. Tambahkan 1-2 ml
HNO
3
jika diperkirakan masih ada karbonnya dan panaskan. Larutan
yang dihasilkan kemudian didinginkan. Setelah dingin, larutan kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman dan
diencerkan sampai volume 100 ml dengan menggunakan air demineralisasi. Hasil pengabuan basah ini selanjutnya siap untuk
dianalisis dengan menggunakan AAS. c.
Kalibrasi alat dan penetapan sampel 1. Set alat AAS sesuai dengan instruksi dalam manual alat tersebut
2. Ukur larutan standar logam dan blanko 3. Ukur larutan sampel selama penetapan sampel, periksa secara
periodik apakah nilai standar tetap konstan 4. Buat kurva standar untuk masing-masing logam nilai absorpsi vs
konsentrasi logam dalam mgL. d.
Perhitungan Konsentrasi natrium total dalam sampel dihitung dengan
menggunakan rumus sebagai berikut :
Kadar logam mg1000 g = a x 1000 g x FP W
Keterangan :
W = berat sampel g a = konsentrasi larutan sampel yang terbaca dari kurva standar
mgL FP = faktor pengenceran
10. Nilai pH AOAC, 1984
