12
1. Isolasi dan Seleksi Bakteri
Pengambilan sampel dilakukan dengan mengambil biji kopi dari feses luwak di perkebunan Kopi Cukul, Desa Pangalengan Bandung. Sampel yang diambil berupa biji kopi terbungkus feses
yang masih segar. Setiap dua biji kopi dari feses luwak dimasukkan ke dalam media tumbuh Carboxymethyl Cellulose CMC cair 100 ml dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang.
Cairan pada hasil inkubasi disuspensikan dalam larutan garam fisiologis NaCl 0.85 dan dilakukan pengenceran dari 10
-1
hingga pengenceran 10
-6
karena pada pengenceran 10
-6
bakteri lebih mudah untuk diamati. Metode isolasi bakteri mengggunakan metode cawan sebar pada media selektif
yaitu media xilan. Bakteri xilanolitik ditumbuhkan pada media agar-agar xilan 0.5. Hasil penyebaran diinkubasi pada suhu 37
o
C selama ±48 jam untuk mendapatkan isolat xilanolitik. Koloni- koloni yang tumbuh dimurnikan kembali pada media agar-agar xilan dan disimpan di lemari
pendingin dengan suhu 4
o
C untuk tahapan berikutnya. Koloni-koloni yang telah murni di totolkan pada media agar-agar xilan dan diinkubasi selama
24 jam pada suhu 37
o
C. Setelah itu, akan telihat zona bening yang ada disekitar koloni. Jika zona bening belum terlihat, dapat diberi larutan merah kongo 0.1 0.1 g congo red dalam 100 ml alkohol
96 dan didiamkan selama 15 menit. Setelah itu, media dicuci menggunakan NaCl fisiologis 0.2 M dan disimpan dilemari pendingin dengan suhu 4
o
C selama 24 jam. Seleksi bakteri dilakukan berdasarkan nisbah zona bening terhadap diameter koloni pada media xilan. Nilai indeks potensial
IP bakteri dapat dihitung berdasarkan nisbah antara diameter zona bening terhadap diameter koloni.
2. Uji Aktivitas Enzim Miller, 1959
a. Pembuatan kurva pertumbuhan dan Produksi Enzim
. Isolat terpilih diremajakan pada media agar-agar xilan, diinkubasi pada suhu 37
o
C selama ±48 jam. Pembuatan inokulum dilakukan dengan mengambil 1-2 koloni dan ditumbuhkan dalam 10 ml
media cair xilan pada tabung reaksi, diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Sebanyak 1 ml inokulum dikultivasikan ke dalam masing-masing labu Erlenmeyer berisi 100 ml media cair xilan.
Inkubasi dilakukan pada shaker inkubator dengan kecepatan 80 rpm pada suhu ruangan. Pada pembuatan kurva tumbuh, setiap12 jam diukur kekeruhan sel menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 620 nm dan sebanyak 4 ml di sentrifugasi pada kecepatan 2850 rpm selama 25 menit untuk mendapatkan enzim ekstrak kasar. Enzim ekstrak kasar digunakan untuk pengujian
aktivitas enzim dan kadar protein.
13
b. Pengujian Aktivitas Enzim
Aktivitas enzim xilanase diukur dengan menghitung kandungan xilosa yang terbentuk dan dianalisis menggunakan metode DNS atau Dinitrosalicylic Miller 1959. Pengujian aktivitas enzim
dilakukan dengan memasukkan 500 L enzim ekstrak kasar dan 500 L larutan substrat xilan 0.5 dalam buffer fosfat pH 7 ke dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 40
C selama 1 jam. Untuk menghentikan reaksi, ditambahkan 1 ml larutan DNS, selanjutnya dipanaskan pada suhu 100
C selama 15 menit, didinginkan dan diukur den gan spektrofotometer pada 540 nm. Aktivitas enzim
xilanase diperoleh berdasarkan mikromol enzim yang dihasilkan per menit dan dapat dihitung dengan rumus:
Keterangan : S: konsentrasi gula pereduksi sampel
K: konsentrasi gula pereduksi kontrol
c. Aktivitas Spesifik Enzim yang dihasilkan Isolat Terpilih
.
Aktivitas spesifik dihitung berdasarkan nilai aktivitas enzim dibagi dengan nilai kadar protein
metode Bradford, 1976. Pengujian kadar protein dilakukan dengan memasukan 2 ml larutan Bradford ke dalam tabung berisi 200 L enzim ekstrak kasar, dihomogenkan, kemudian didiamkan
selama 15 menit dan diukur dengan s pektrofotometer pada 5λ5 nm. Pengujian kadar protein
menggunakan BSA Bovin Serum Albumin sebagai standar. Metode pembuatan standar BSA dapat dilihat pada Lampiran1.
3. Fermentasi
Kategori