Jenis dan Rancangan Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

18

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel utama

a. Variabel bebas. b. Variabel bebas yang dipakai dalam penelitian ini adalah variasi dosis ekstrak etanol kulit buah P. americana Mill.. Variabel tergantung.

2. Variabel pengacau

Variabel tergantung yang dipakai dalam penelitian ini adalah efek hepatoprotektif ekstrak etanol kulit buah P. americana Mill. yang dilihat dari aktivitas ALT - AST tikus jantan galur Wistar. a. Kondisi hewan uji, yaitu tikus galur Wistar berjenis kelamin jantan, umur 2-3 bulan dan mempunyai berat badan 150-250 g, frekuensi pemberian ekstrak etanol kulit buah P. americana selama 6 jam dan pemberiannya secara per oral, cara pemberian hepatotoksin secara intraperitonial, bahan uji yang digunakan berupa kulit buah P. americana. Variabel pengacau terkendali. b. Kondisi patologis dari hewan uji. Variabel pengacau tak terkendali

3. Definisi operasional

a. Kulit buah P. americana. b. Kulit buah P. americana diambil dari buah P. americana Mill. yang telah matang, memiliki warna kulit yang hijau tua, kulit buah tidak busuk dan masih segar, diperoleh dari satu depot Es Teler yaitu Es Teler 77 dan diambil selama periode juni-juli 2014. Ekstrak etanol kulit buah P. american Mill.. c. Ektrak etanol kulit buah P. americana merupakan ekstrak kental dari serbuk kering kulit buah P. americana seberat 40,0 g yang dilarutkan dalam 200 mL pelarut etanol 70 secara maserasi selama 5x24 jam, hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas saring, sehingga diperoleh filtrat. Serbuk sisa perendaman diremaserasi kembali dengan pelarut etanol 70 selama 2 hari dengan sesekali penggojogan. Setelah dilakukan penggojogan disaring, dievaporasi, diuapkan di atas waterbath pada suhu 80 C hingga bobot tetap. Efek hepatoprotektif. d. Kemampuan ekstrak etanol kulit buah P. americana terhadap penurunan ALT-AST tikus jantan galur Wistar yang terinduksi karbon tetraklorida yang sebelumnya telah diberikan ekstrak etanol kulit buah P. americana dalam jangka pendek Pemberian jangka pendek e. . Pemberian ekstrak etanol kulit buah P. americana kepada hewan uji dengan waktu 6 jam sebelum pemberian karbon tetraklorida. Dosis efektif. Pemilihan dosis terkecil yang mampu memberikan penurunan aktivitas serum ALT dan AST.

C. Bahan Penelitian

1. Bahan utama

a. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur Wistar berumur 2-3 bulan dengan berat badan 150-250 g yang diperoleh dari Laboratorium Imunologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Bahan uji yang digunakan adalah serbuk kering kulit buah P. americana yang diperoleh dari sebuah depot Es Teler 77 di Yogyakarta bulan Juni- Juli 2014.

2. Bahan kimia

a. Karbon tetraklorida yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta b. Etanol pelarut ekstrak diperoleh dari General Labora Yogyakarta c. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak etanol kulit buah P. americana adalah larutan 1 CMC-Na yang diperoleh dari Laboratorium Biofarmasetika Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta d. Kontrol negatif yang digunakan adalah olive oil merk Bertoli yang dibeli dari Superindo Yogyakarta. e. Pelarut ekstrak etanol kulit buah P. americana yang digunakan adalah CMC-Na dalam bentuk serbuk yang diperoleh dari Laboratorium Biofarmasetika Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. f. Reagen ALT Reagen serum yang digunakan adalah reagen ALT Diasys. Komposisi dan Konsentrasi dari reagen ALT adalah sebagai berikut : Tabel I. Komposisi dan Konsentrasi reagen ALT Komposisi pH Konsentrasi R1 : TRIS 7.15 140 mmolL L-Alanine 700 mmolL LDH Lactate dehydrogenase ≥ 2300 UL R2 : 2-Oxoglutarate 85 mmolL NADH 1 mmolL Pyridoxal-5phosphate FS : Good’s buffer Pyridoxal-5- phosphate 9,6 100 mmolL 13 mmolL g. Reagen AST Reagen serum yang digunakan adalah reagen AST Diasys. Komposisi dan Konsentrasi dari reagen AST adalah sebagai berikut : Tabel II. Komposisi dan Konsentrasi reagen AST Komposisi pH Konsentrasi R1 : TRIS 7.15 110 mmolL L-Aspartate 320 mmolL MDH malate dehydrogenase ≥ 800 UL LDH lactate dehydrogenase ≥ 1200 mmolL R2 : 2-Oxoglutarate 65 mmolL NADH 1 mmolL Pyridoxal-5phosphate FS : Good’s buffer Pyridoxal-5- phosphate 9,6 100 mmolL 13 mmolL

D. Alat Penelitian

1. Alat ektraksi

Alat-alat gelas yang meliputi gelas ukur, labu ukur, cawan porselen, Erlenmeyer, Bekker glass, corong Buchner, batang pengaduk, Mesin penyerbuk, pipet tetes, ayakan No. 40 Electric Sieve Shaker, timbangan analitik Mettler, moisture balance, orbital shaker , rotary vacuum evaporator, oven , dan waterbath.

2. Alat uji hepatoprotektif

Alat-alat gelas yang meliputi Bekker glass, tabung reaksi, batang pengaduk, gelas ukur, pipet tetes. Timbangan elektrik, vortex Genie, sentrifuge Centurion , spuit per oral, spuit inta vena, syringe 3 cc Terumo®, pipa kapiler, dan tabung Eppendorf.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi buah

P. americana

Determinasi dilakukan dengan mencocokkan buah P. americana yang diperoleh dari depot Es Teler 77 di Yogyakarta dengan buah P. americana berdasarkan acuan determinasi tanaman P. americana Agrilink, 2001.

2. Pengumpulan bahan uji

Bahan uji yang digunakan adalah kulit buah P. americana. Pemilihan kulit buah P. americana yang digunakan adalah buah P. americana yang sudah matang, kulit buah yang masih segar, warna kulit hijau tua dan kulit buah tidak membusuk. Kulit buah P. americana diperoleh dari depot Es Teler 77 di Yogyakarta periode Juni –Juli 2014.

3. Pembuatan serbuk kulit buah

P. americana

Kulit buah P.americana dicuci bersih di bawah air mengalir. Setelah bersih kulit dipotong kecil-kecil dan diangin-anginkan hingga kulit tidak tampak basah kemudian dilakukan pengeringan menggunakan oven pada suhu 50 ˚C selama 24 jam. Setelah kering kulit dibuat serbuk dan diayak dengan ayakan nomor 40 karena jika serbuk terlalu halus akan mengendap pada saat maserasi sehingga mempengaruhi proses ekstraksi. Pernyataan tersebut berdasarkan teori bahwa pada saat melakukan ekstrak suatu simplisia, tidak jarang terjadi bagian potongan yang sangat halus dari simplisia melewati penyaring sehingga dapat membentuk endapan Agoes, 2009

4. Penetapan kadar air dalam serbuk kering kulit buah

P. americana

Penetapan kadar air serbuk kulit buah P. americana bertujuan untuk mengetahui kadar air dalam serbuk dan untuk memenuhi persyaratan serbuk yang baik, yaitu kurang dari 10 Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995. Penetapan kadar air serbuk kulit buah P. americana dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada Yogyakarta menggunakan metode gravimetri.

5. Pembuatan sediaan etanol kulit buah

P. americana

Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi. Sebanyak 40 g serbuk kulit buah P. americana direndam dalam 200 ml pelarut etanol 70 pada suhu kamar selama 5 x 24 jam. Setelah dilakukan perendaman, hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas saring sehingga diperoleh filtrat. Serbuk sisa perendaman dimaserasi kembali dengan 200 mL etanol 70 selama 2 x 24 jam. Filtrat hasil saringan dipindahan ke labu alas bulat untuk dievaporasi untuk menguapkan cairan penyari pada proses maserasi. Hasil evaporasi dituangkan dalam cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya karena hasil ekstrak merupakan ekstrak kental yang memiliki sifat lengket. Cawan porselen yang berisi larutan hasil evaporasi diuapkan di atas waterbath dengan suhu 80 C untuk mendapatkan ekstrak etanol kulit buah P. amerciana dengan bobot pengeringan ekstrak yang tetap, kemudian dilakukan perhitungan rata-rata rendemen dari replikasi ekstrak etanol kulit buah P. americana kental yang telah dibuat. Persen rendemen ekstrak kental kulit buah P. americana diperoleh berdasarkan perhitungan : Rendemen = total ekstrak kulit buah �.��������� Mill . total serbuk kulit buah �.��������� Mill . X 100

6. Pembuatan CMC-Na 1

Ditimbang sebanyak 1,0 gram CMC-Na kemudian dilarutkan menggunakan aquadest 50 mL, didiamkan selama 24 jam hingga CMC-Na mengembang setelah itu di add dengan aquadest hingga 100 mL pada labu ukur 100 mL.

7. Penetapan konsentrasi ekstrak

Konsentrasi yang dapat digunakan yaitu konsentrasi pekat yang dapat dibuat dimana pada konsentrasi tersebut ekstrak dapat dimasukkan serta dikeluarkan dari spuit oral. Cara pembuatannya dengan melarutkan Sebanyak 3,5 gram ekstrak dalam labu ukur 50 mL dengan pelarut yang sesuai yaitu CMC-Na 1 sehingga konsentrasi ekstrak dapat ditetapkan sebesar 7 bv atau 0,07 grammL atau 70 mgmL. Penetapan konsentrasi ekstrak kulit buah P.americana ini mengacu pada penelitian Sasadara 2013.

8. Penetapan dosis ekstrak etanol kulit buah

P. amerciana

Penetapan peringkat dosis didasarkan pada perhitungan dengan bobot tikus terbesar 250 mg, konsentrasi ektrak kulit buah P. americana yang dapat dimasukkan dan dikeluarkan melalui spuit oral yaitu 7 atau 70 mgmL, serta volume maksimal pemberian oral yaitu 5 mL, maka dosis tertinggi dapat ditentukan sebagai berikut: BB x D = C x V 0,250 kg x D = 70 mgmL x 5 mL  D= 1400 mgkg BB Dosis tengah dan dosis rendah ditentukan dengan menurunkan dua kelipatan dari dosis tertinggi, sehingga diperoleh dosis 700 dan 350 mgKg BB. Dosis yang digunakan 350, 700, dan 1400 mgkg BB. Penetapan dosis ekstrak etanol kulit buah P.americana ini mengacu pada penelitian Nopitasari 2013.

9. Pembuatan larutan karbon tetraklorida dalam

olive oil Larutan karbon tetraklorida dalam olive oil dibuat dengan cara mengambil volume karbon tetraklorida secara seksama, kemudian dilarutkan dengan olive oil dengan perbandingan 1 : 1. 10. Uji pendahuluan a. Pemilihan dosis karbon tetraklorida dilakukan untuk mengetahui dosis karbon tetraklorida yang mampu menyebabkan kerusakan pada organ hati tikus dengan melihat peningkatan aktivitas serum ALT dan AST paling tinggi tetapi tidak menimbulkan kematian. Berdasarkan Penetapan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida penelitian Wijaya 2013 dosis 2 mLKgBB karbon tetraklorida secara intraperitoneal mampu memberikan efek hepatotoksik. b. Aktivitas peningkatan ALT dan AST pada tikus teriduksi karbon tetraklorida dengan dosis 2 mLKgBB secara intraperitoneal diukur pada jam ke-24, 48 dan72 setelah pemejanan. Hasil yang diperoleh dilihat kenaikan yang paling tinggi dari kedua serum tersebut. Waktu peningkatan serum ALT dan AST yang paling tinggi akan dijadikan sebagai waktu pencuplikan darah dalam penelitian antihepatotoksik. Penetapan waktu cuplikan darah c. Pemberian ekstrak metanol biji P. americana pada rentang waktu 6 jam sebelum induksi karbon tetraklorida merupakan waktu yang paling efektif diberikan dengan nilai persen hepatoprotektif sebesar 101 dengan dosis pemberian ekstrak metanol biji P. americana 350 mgkgBB Sasadara, 2013. Penetapan waktu pemberian ekstrak kulit buah P. americana

11. Pengelompokkan hewan uji

Tiga puluh ekor tikus dibagi ke dalam enam kelompok perlakuan secara acak dengan masing-masing sebanyak 5 ekor tikus. a. Kelompok I kontrol hepatotoksin larutan campuran karbon tetraklorida : olive oil 1:1 dosis 2 mLkgBB secara intraperitoneal. b. Kelompok II kontrol negatif diberi olive oil dosis 2 mLkgBB secara intraperitoneal. c. Kelompok III kontrol ekstrak diberi ekstrak etanol kulit buah P. americana dosis 1,4 gkg BB secara peroral. d. Kelompok IV dosis rendah diberi ekstrak etanol kulit buah P. americana dengan dosis 0,35 gkg BB secara peroral. e. Kelompok V dosis tengah diberi ekstrak etanol kulit buah P. americana dengan dosis 0,70 gkg BB secara peroral. f. Kelompok VI dosis tinggi diberi ekstrak etanol kulit buah P. americana dengan dosis 1,4 gkg BB secara peroral. Enam jam setelah pemberian ekstrak etanol kulit buah P. americana, maka kelompok IV-VI dipejani dengan karbon tetraklorida dosis 2 mLkgBB secara intraperitoneal, lalu setelah 24 jam diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata, kemudian dilakukan pengujian aktivitas ALT-AST.

12. Pembuatan serum

Pengambilan darah dilakukan pada bagian sinus orbitalis mata tikus lalu ditampung dalam tabung Eppendorf. Darah didiamkan selama ± 15 menit, kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 8000 rpm dan bagian supernatannya diambil. Kemudian dilakukan resentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 menit.

13. Pengukuran aktivitas ALT-AST pada serum

Aktivitas ALT dan AST dinyatakan dalam UL. aktivitas enzim diukur pada panjang gelombang 340 nm, pada suhu 37 C dengan faktor koreksi 1745. Pengukuran aktivitas ALT dan AST ini dilakukan di Laboratorium Parahita Yogyakarta.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data aktivitas ALT-AST dianalisis dengan Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui normalitas data pada masing-masing kelompok perlakuan. Nilai normal suatu data ditunjukkan dengan nilai p0,05. Apabila hasil analisis statistik Kolmogorov-Smirnov aktivitas ALT-AST menunjukkan distribusi data normal, dilanjutkan dengan analisis One Way Anova dengan tingkat kepercayaan 95. Analisis ini digunakan untuk melihat homogenitas data. Apabila hasil tersebut menunjukkan nilai signifikansi p0,05, berarti data tersebut homogen. Tahap selanjutnya dengan uji Scheffe untuk mengetahui kebermaknaan perbedaan antar kelompok, jika diperoleh distribusi data yang tidak normal maka dilakukan analisis data menggunakan Kruskal-Wallis untuk melihat homogenitasnya, dan dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney untuk melihat kebermaknaan perbedaan antar kelompok. Menurut penelitian Wijaya 2014 perhitungan persen efek hepatoprotektif terhadap hepatotoksin parasetamol diperoleh dengan rumus sebagai berikut : [1 − ������ ��� ��������� −������ ��� ������� ������� ������ ��� ������� ������ ������������ −������ ��� ������� ������� ] x 100 29

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini memiliki tujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian dan besar dosis efektif hepatoprotektif ekstrak etanol kulit buah P. americana jangka pendek pada tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida. Penelitian ini merupakan pengembangan dari penelitian sebelumnya yang sudah menguji mengenai efek hepatoprotektif ekstrak etanol biji P. americana jangka panjang terhadap tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida Nopitasari, 2013. Pengukuran efek hepatoprotektif ekstrak etanol kulit buah P. americana dengan melihat hasil aktivitas serum ALT dan AST. Efek hepatoprotektif ditunjukkan berdasarkan penurunan aktivitas dari serum ALT dan AST setelah pemberian ekstrak etanol kulit buah P. americana pada tikus jantan galur Wistar yang terinduksi karbon tetraklorida. Aktivitas serum ALT dan AST yang diukur dalam penelitian ini karena berdasarkan penelitian-penelitian terdahulu pada umumnya kerusakan hati dapat dilihat dengan pengukuran aktivitas serum ALT dan AST. Menurut Sihombing dan Raflizar 2010, bahwa untuk menilai fungsi hepar dipilih uji serum transaminase yaitu ALT dan AST yang merupakan indikator sensitif pada kerusakan sel-sel hepar.

A. Penyiapan Bahan

1. Hasil determinasi tanaman

Penelitian efek hepatoprotektif menggunakan kulit buah P. americana sebagai bagian tanaman yang digunakan dalam uji aktivitas antihepatotoksik. Determinasi digunakan untuk memastikan kebenaran bagian tanaman yang