21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
perlahan. Setelah padat, ekstrak pekat yang telah dilarutkan dengan eluen dimasukkan ke dalam kolom menggunakan pipet tetes, lalu dielusi dengan eluen
yang telah ditentukan sebelumnya dengan KLT. Fraksi yang keluar ditampung dalam tabung reaksi dan dimonitor dengan KLT menggunakan eluen
diklorometan:metanol 15:1. Selanjutnya, fraksi-fraksi yang memiliki pola kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapatkan
8 fraksi dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Fraksi 3 10,4 mg yang masih menunjukkan beberapa noda, difraksinasi
kembali dengan kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel 70-230 mesh dan fase gerak n-heksana:etil asetat 3:1. Fraksi yang keluar ditampung
dalam tabung reaksi dan dimonitor dengan KLT menggunakan eluen n-heksana:etil asetat 2:1. Selanjutnya, fraksi-fraksi yang memiliki pola
kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapatkan 6 fraksi dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator.
3.4.4 Penentuan Nilai KHM Kadar Hambat Minimum
3.4.4.1 Persiapan Medium
Medium yang digunakan yaitu medium MHB Mueller Hinton Broth untuk pertumbuhan bakteri uji dan medium MHA Mueller Hinton Agar untuk
perhitungan jumlah koloni bakteri uji. a Medium MHB dibuat dengan komposisi: medium MHB 1 dibuat dengan
melarutkan 21 g MHB dalam 1 Liter aquadest dan medium MHB 2 dibuat dengan komposisi 2x medium MHB 1 42 g MHB dalam 1 Liter aquadest.
Setelah larut, medium disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15
menit. b Medium MHA dibuat dengan melarutkan 38 gram MHA dalam 1 Liter
aquadest. Setelah larut, medium disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 C
selama 15 menit. Setelah itu, medium dituang dalam beberapa cawan petri steril dan dibiarkan memadat.
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.4.2 Persiapan Larutan Uji
Larutan uji yang digunakan yaitu fraksi 3e. Larutan uji dibuat konsentrasi 512 µgmL dengan menggunakan pelarut DMSO 30. Fraksi 3e 1,4 mg
dilarutkan dalam 1,4 mL metanol, kemudian dipipet sebanyak 512 µL ke dalam vial dan dikeringkan dengan nitrogen. Setelah itu, dilarutkan dengan pelarut
DMSO 30 DMSO 300 µL dan aquabidest 700 µL.
3.4.4.3 Persiapan Bakteri Uji
Bakteri uji yang digunakan yaitu S. aureus dan E. coli. Persiapan bakteri uji terdiri dari:
a Pembuatan suspensi bakteri Sebanyak 1 ose isolat bakteri diinokulasikan ke dalam 20 mL medium
MHB. Kemudian diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 37
C selama 18 jam. b Pengenceran suspensi bakteri
Suspensi bakteri uji diencerkan untuk mempermudah perhitungan koloni, yaitu dengan cara dipipet 50 µL suspensi bakteri ke dalam 4.950 µL aquadest
steril sehingga didapat pengenceran 10
-2
, dari suspensi bakteri pengenceran 10
-2
dipipet 50 µL ke dalam 4.950 µL aquadest steril sehingga didapat pengenceran 10
-4
. Suspensi tersebut diencerkan lagi dengan cara yang sama hingga didapat suspensi dengan pengenceran 10
-6
, 10
-8
, dan 10
-10
. c Perhitungan jumlah koloni bakteri
Suspensi dengan faktor pengenceran 10
-6
, 10
-8
, dan 10
-10
, diinokulasikan sebanyak 100 µL kedalam medium MHA, disebarkan menggunakan spreader.
Kemudian diinkubasi dalam incubator pada suhu 37 C selama 18 jam. Koloni
bakteri yang muncul dihitung Lampiran 5.
Jumlah koloni bakteri = Koloni yang muncul x faktor pengenceran
Volume yang dipipet
