23
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
d Pengenceran bakteri untuk uji KHM Stok bakteri yang digunakan untuk uji KHM dibuat dengan cara
mengencerkan suspensi bakteri awal menjadi 10
5
CFUmL berdasarkan hasil dari perhitungan jumlah koloni bakteri yang digunakan Lampiran 5.
3.4.4.4 Pengenceran Larutan Uji
Pengenceran larutan uji dari konsentrasi 512 µgmL menjadi 128 µgmL, 64 µgmL, 32 µgmL, 16 µgmL, 8 µgmL, 4 µgmL, dan 1 µgmL menggunakan
96 well microtiter plate dengan komposisi sebagai berikut: a Sumur A1-A9 diisi dengan 100 µL medium MHB 2.
b Sumur B1-H9 diisi dengan 100 µL medium MHB 1. c Sumur A1-A3 diisi dengan 100 µL sampel uji.
d Sumur A4-A6 diisi dengan 100 µL eritromisin antibiotic control. e Sumur A7-A9 diisi dengan 100 µL kloramfenikol antibiotic control.
f Dari sumur A1-A9 masing-masing diambil 100 µL dan dimasukkan dalam sumur B1-B9, begitu seterusnya sampai sumur H1-H9. Pada sumur H1-H9
diambil 100 µL dan dibuang. g Sumur A10 diisi 200 µL dengan medium MHB 2 sterility control.
h Sumur B10 diisi 200 µL dengan medium MHB 1 sterility control. i Sumur C10-D10 diisi 100 µL dengan medium MHB 1 growth control.
j Sumur E10-F10 diisi 100 µL dengan medium MHB 2 dan 100 µL DMSO 30 dan dibuang 100 µL solvent control.
k Sumur G10-H10 diisi 100 µL dengan medium MHB 2 dan 100 µL etanol 30 dan dibuang 100 µ L solvent control.
l Masing-masing sumur ditambah dengan bakteri uji 100 µL kecuali sumur untuk sterilitiy control.
3.4.4.5 Inkubasi Microtiter Plate yang Berisi Sampel Uji
Microtiter plate yang berisi sampel uji diinkubasi dalam incubator pada suhu 37
C selama 18 jam.
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.4.6 Penentuan Nilai KHM
Nilai KHM ditetapkan secara visual sebagai kadar larutan uji antibakteri terendah yang terlihat bening setelah penambahan reagensia pewarna INT
4 mgmL tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji.
3.4.5 Identifikasi Secara Makroskopis dan Mikroskopis Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai Antibakteri Isolat 1-3-1-1
Identifikasi dilakukan berdasarkan panduan Gandjar et al. 1999 dengan mengamati beberapa karakter morfologi baik secara makroskopis maupun
mikroskopis. Secara makroskopis karakter yang diamati meliputi: warna dan permukaan koloni granular, seperti tepung, menggunung, licin, tekstur, garis-
garis radial dan konsentris, warna balik koloni reverse color, dan tetes eksudat. Pengamatan secara mikroskopis meliputi: ada tidaknya septat pada hifa,
pigmentasi hifa, dan bentuk spora. Identifikasi secara mikroskopik dilakukan dengan cara:
a Membersihkan kaca objek dan kaca penutup dengan alkohol 70. b Meletakkan setetes zat pewarna trypan blue di tengah kaca objek.
c Mengambil sedikit hifa jamur dengan jarum preparat dan diletakkan pada tetesean zat pewarna trypan blue dalam kaca objek dan ditutup dengan kaca
penutup secara hati-hati. d Preparat diamati di bawah mikroskop cahaya dengan skala perbesaran 1000x.
