Waktu dan Tempat Tahapan Penelitian

16 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2-4-Iodofenil-3-4-nitrofenil-5-fenil-2H-tetrazolium klorida, trypan blue, crystal violet, safranin, larutan lugol, antibiotik kloramfenikol dan eritromisin. Tabel 3.1 Data isolat jamur endofit dari tanaman Kina Cinchona pubescens Vahl. No Kode Isolat Asal Isolat 1 5-1-8-5 Daun 2 1-2-5-3 Tangkai daun 3 2-2-6-4 Tangkai daun 4 3-2-10-2 Tangkai daun 5 2-3-4-2 Bunga 6 3-3-4-2 Bunga 7 1-2-4-4 Tangkai daun 8 1-2-6-3 Tangkai daun 9 3-2-1-2 Tangkai daun 10 1-3-1-1 Bunga

3.3 Tahapan Penelitian

3.3.1 Skrining aktivitas antibakteri jamur endofit dari tanaman Kina Cinchona pubescens Vahl. 3.3.2 Scaling up jamur endofit yang paling aktif sebagai antibakteri 3.3.3 Fraksinasi dan purifikasi metabolit bioaktif antibakteri 3.3.4 Penentuan nilai KHM Kadar Hambat Minimum 3.3.5 Identifikasi secara makroskopik dan mikroskopik jamur endofit yang paling aktif sebagai antibakteri 17 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Skrining Aktivitas Antibakteri Jamur Endofit dari Tanaman Kina

Cinchona pubescens Vahl. 3.4.1.1 Kultivasi Jamur Endofit Proses kultivasi dilakukan terhadap 10 isolat murni jamur endofit yang diisolasi dari bagian daun, tangkai daun, dan bunga tanaman Kina yang dibagi menjadi 2 tahap kultivasi: kultivasi pertama dilakukan terhadap 6 isolat jamur isolat no. 1-6 dan kultivasi kedua dilakukan terhadap 4 isolat jamur isolat no. 7-10. Setiap isolat diambil sebanyak 1 ose dari stock culture pada medium PDA Potato Dextrose Agar miring dan diinokulasikan pada masing-masing 40 mL medium PDB Potato Dextrose Broth dan GYP Glucose Yeast extract Peptone yang sudah steril, proses inokulasi ini dilakukan secara steril di dalam laminar air flow. Proses kultivasi jamur dilakukan selama 3 minggu pada suhu ruang.

3.4.1.2 Ekstraksi Kultur Jamur Endofit

Sebanyak 6 kultur jamur endofit isolat no. 1-6 yang sudah dikultivasi tahap pertama pada medium PDB dan GYP diekstraksi dengan pelarut etil asetat:metanol 4:1, sedangkan untuk 4 kultur jamur isolat no. 7-10 yang dikultivasi tahap kedua pada medium PDB dan GYP diekstraksi dengan etil asetat:metanol 4:1 dan fraksi airnya diekstraksi lagi dengan kloroform. Jumlah pelarut yang digunakan pada masing-masing ekstraksi sebanyak 40 mL yaitu 1:1 dengan jumlah medium kultur jamur. Proses ekstraksi dilakukan menggunakan corong pisah sebanyak tiga kali. Untuk ekstraksi dengan pelarut etil asetat:metanol 4:1 diambil lapisan atas fraksi etil asetat:metanol, sedangkan untuk ekstraksi dengan pelarut kloroform diambil lapisan bawah fraksi kloroform. Masing-masing fraksi dipisahkan dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Ekstrak pekat yang didapat dari masing-masing fraksi ditimbang dan dilarutkan dengan metanol dalam jumlah tertentu sehingga masing- masing ekstrak diperoleh konsentrasi 10 mgmL. Selanjutnya dilakukan uji KLT dengan menggunakan fase gerak diklorometan:metanol 7:1 dan hasilnya diamati dibawah sinar UV 254 nm dan UV 366 nm serta disemprot dengan pereaksi 18 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta penampak noda serium sulfat untuk skrining metabolit sekunder dan pereaksi Dragendorff untuk skrining senyawa alkaloid.

3.4.1.3 Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Bioautografi

a Identifikasi Bakteri Uji dengan Pewarnaan Gram Identifikasi bakteri uji dengan pewarnaan Gram ini dilakukan berdasarkan panduan Alexander et al., 2004 dengan cara: 1. Kaca objek dibersihkan dengan alkohol 70 dan dikeringkan. 2. Aquadest steril diteteskan pada kaca objek kemudian diinokulasikan bakteri uji menggunakan ose dan difiksasi diatas api bunsen. 3. Diteteskan crystal violet, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air selama 5 detik. 4. Diteteskan dengan larutan lugol, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air selama 5 detik. 5. Dihilangkan warnanya dengan alkohol 95 selama 15-30 detik, kemudian dicuci dengan air selama 5 detik. 6. Diteteskan zat warna safranin dan didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air selama 5 detik.. 7. Preparat difiksasi diatas api bunsen dan diamati dengan mikroskop cahaya dengan skala perbesaran 400x dan 4000x. b Persiapan Suspensi Bakteri Stok bakteri uji S. aureus dan E. coli yang telah diremajakan pada medium NA nutrient Agar miring diambil 1 ose, lalu disuspensikan dalam 20 mL medium BHI Brain Heart Infusion, kemudian diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 37 C selama 18 jam. c Persiapan Sampel Uji Semua sampel dibuat konsentrasi menjadi 10 mgmL, kemudian sebanyak 10 µL dari masing-masing sampel ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada plat KLT. Sebagai kontrol positif digunakan antibiotik kloramfenikol dengan konsentrasi 1 mgmL dan kontrol negatif medium PDB, GYP, dan pelarut metanol.