20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
perbandingan 1:1 terhadap jumlah fraksi airnya. Proses ekstraksi ini dilakukan secara berulang sebanyak 3 kali. Lapisan bawah yang merupakan fraksi kloroform
dari medium dan biomassa jamur dipisahkan dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Ekstrak pekat yang didapat dilarutkan dengan metanol dan
dilakukan uji KLT dengan menggunakan fase gerak diklorometan:metanol 15:1 dan hasilnya diamati dibawah sinar UV 254 nm dan UV 366 nm serta disemprot
dengan pereaksi penampak noda serium sulfat.
3.4.2.4 Uji KLT-Bioautografi Ekstrak Jamur Endofit Hasil Scaling Up
Berdasarkan proses ekstraksi pada kultur jamur endofit no. 10 isolat 1-3-1-1 hasil scaling up, didapat 2 ekstrak sampel yaitu: ekstrak kloroform
medium jamur dan ekstrak kloroform biomassa jamur. Ekstrak tersebut dibuat konsentrasi menjadi 10 mgmL, kemudian sebanyak 10 µL dari masing-masing
ekstrak ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada plat KLT dan dielusi menggunakan pelarut diklorometan:metanol 15:1. Setelah itu, plat KLT
dicelupkan kedalam suspensi bakteri uji dan diinkubasi pada suhu 37 C selama
18 jam. Plat KLT yang telah diinkubasi disemprot dengan reagensia pewarna INT 4 mgmL dan diinkubasi selama 1-2 jam. Selanjutnya dilakukan penghitungan
nilai Rf Retardation factor terhadap senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri. Keberadaan aktivitas antibakteri ditentukan dengan terbentuknya zona
hambat yang tampak karena penyemprotan INT yang dikonversikan terhadap warna formazan pada mikroorganisme hidup.
3.4.3 Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri
Berdasarkan hasil pengamatan uji KLT-bioautografi, selanjutnya dilakukan fraksinasi dan purifikasi metabolit bioaktif dari ekstrak kloroform
biomassa jamur 161,7 mg dengan kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel 70-230 mesh dan fase gerak kloroform:metanol 30:1. Fase diam
disuspensikan kedalam fase gerak eluen kemudian dimasukkan secara perlahan melalui corong ke dalam kolom yang telah diisi kapas dan seasand di bagian
bawah kolom. Untuk penyempurnaan proses pemisahan, fase diam dipadatkan dengan cara menurunkan fase gerak serta dinding kolom diketok-ketok secara
21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
perlahan. Setelah padat, ekstrak pekat yang telah dilarutkan dengan eluen dimasukkan ke dalam kolom menggunakan pipet tetes, lalu dielusi dengan eluen
yang telah ditentukan sebelumnya dengan KLT. Fraksi yang keluar ditampung dalam tabung reaksi dan dimonitor dengan KLT menggunakan eluen
diklorometan:metanol 15:1. Selanjutnya, fraksi-fraksi yang memiliki pola kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapatkan
8 fraksi dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Fraksi 3 10,4 mg yang masih menunjukkan beberapa noda, difraksinasi
kembali dengan kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel 70-230 mesh dan fase gerak n-heksana:etil asetat 3:1. Fraksi yang keluar ditampung
dalam tabung reaksi dan dimonitor dengan KLT menggunakan eluen n-heksana:etil asetat 2:1. Selanjutnya, fraksi-fraksi yang memiliki pola
kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapatkan 6 fraksi dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator.
3.4.4 Penentuan Nilai KHM Kadar Hambat Minimum
3.4.4.1 Persiapan Medium
Medium yang digunakan yaitu medium MHB Mueller Hinton Broth untuk pertumbuhan bakteri uji dan medium MHA Mueller Hinton Agar untuk
perhitungan jumlah koloni bakteri uji. a Medium MHB dibuat dengan komposisi: medium MHB 1 dibuat dengan
melarutkan 21 g MHB dalam 1 Liter aquadest dan medium MHB 2 dibuat dengan komposisi 2x medium MHB 1 42 g MHB dalam 1 Liter aquadest.
Setelah larut, medium disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15
menit. b Medium MHA dibuat dengan melarutkan 38 gram MHA dalam 1 Liter
aquadest. Setelah larut, medium disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 C
selama 15 menit. Setelah itu, medium dituang dalam beberapa cawan petri steril dan dibiarkan memadat.
