18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
penampak noda serium sulfat untuk skrining metabolit sekunder dan pereaksi Dragendorff untuk skrining senyawa alkaloid.
3.4.1.3 Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Bioautografi
a Identifikasi Bakteri Uji dengan Pewarnaan Gram
Identifikasi bakteri uji dengan pewarnaan Gram ini dilakukan berdasarkan
panduan Alexander et al., 2004 dengan cara:
1. Kaca objek dibersihkan dengan alkohol 70 dan dikeringkan. 2. Aquadest steril diteteskan pada kaca objek kemudian diinokulasikan bakteri
uji menggunakan ose dan difiksasi diatas api bunsen. 3. Diteteskan crystal violet, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci
dengan air selama 5 detik. 4. Diteteskan dengan larutan lugol, didiamkan selama 1 menit, kemudian
dicuci dengan air selama 5 detik. 5. Dihilangkan warnanya dengan alkohol 95 selama 15-30 detik, kemudian
dicuci dengan air selama 5 detik. 6. Diteteskan zat warna safranin dan didiamkan selama 1 menit, kemudian
dicuci dengan air selama 5 detik.. 7. Preparat difiksasi diatas api bunsen dan diamati dengan mikroskop cahaya
dengan skala perbesaran 400x dan 4000x.
b Persiapan Suspensi Bakteri
Stok bakteri uji S. aureus dan E. coli yang telah diremajakan pada medium NA nutrient Agar miring diambil 1 ose, lalu disuspensikan dalam 20 mL
medium BHI Brain Heart Infusion, kemudian diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 37
C selama 18 jam.
c Persiapan Sampel Uji
Semua sampel dibuat konsentrasi menjadi 10 mgmL, kemudian sebanyak 10 µL dari masing-masing sampel ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada
plat KLT. Sebagai kontrol positif digunakan antibiotik kloramfenikol dengan konsentrasi 1 mgmL dan kontrol negatif medium PDB, GYP, dan pelarut
metanol.
19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
d Uji Bioautografi
Plat KLT yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam suspensi bakteri uji dan diinkubasi pada suhu 37
C selama 18 jam, kemudian disemprot dengan pereaksi warna INT 4 mgmL dan diinkubasi selama 1 jam. Keberadaan
aktivitas antibakteri ditentukan dengan terbentuknya zona hambat yang tampak karena penyemprotan INT yang dikonversikan terhadap warna formazan pada
mikroorganisme hidup.
3.4.2 Scaling up Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai Antibakteri pada
Medium PDB 3.4.2.1 Pembuatan Medium Kultivasi
Medium PDB dibuat sebanyak 2 Liter dengan komposisi 24 gram PDB dalam 1 Liter aquadest. Setelah semua komponennya larut, medium dibagi ke
dalam 4 erlenmeyer berukuran 2 Liter yang masing-masingnya diisi 500 mL. Medium tersebut disterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121
C.
3.4.2.2 Kultivasi Jamur Endofit
Berdasarkan hasil skrining antibakteri, ekstrak kultur jamur yang paling aktif sebagai antibakteri yaitu ekstrak kloroform dari isolat jamur endofit no. 10
isolat 1-3-1-1 yang dikultivasi pada medium PDB. Isolat yang telah diregenerasi pada medium PDA diambil sebanyak ±3 ose dan diinokulasikan ke dalam 4x500
mL medium PDB yang sudah steril. Proses inokulasi ini dilakukan secara steril dalam laminar air flow. Setelah itu, kultur jamur endofit diinkubasi pada suhu
ruang selama 3 minggu.
3.4.2.3 Ekstraksi Kultur Jamur Endofit Hasil Scaling Up
Hasil kultivasi jamur endofit no.10 isolat 1-3-1-1 dipisahkan antara medium dan biomassanya dengan cara disaring. Medium diekstraksi dengan
pelarut kloroform sebanyak 2 Liter dengan perbandingan 1:1 terhadap jumlah medium, sedangkan untuk biomassa dimaserasi terlebih dahulu dengan aseton
3x24 jam, diuapkan asetonnya menggunakan vacuum rotary evaporator sehingga didapat fraksi air yang kemudian diekstraksi dengan pelarut kloroform dengan
