Skrining Aktivitas Antibakteri Jamur Endofit Tanaman Kina Cinchona pubescens Vahl.

26 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta a b c d Gambar 4.1 Profil KLT dari 12 ekstrak yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat dan pereaksi Dragendorff Eluen : diklorometan:metanol 7:1 Keterangan : a Ekstrak etil asetat:metanol 4:1 kultur jamur yang dikultivasi pada medium PDB yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat. b Ekstrak etil asetat:metanol 4:1 kultur jamur yang dikultivasi pada medium PDB yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff. c Ekstrak etil asetat:metanol 4:1 kultur jamur yang dikultivasi pada medium GYP yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat. d Ekstrak etil asetat:metanol 4:1 kultur jamur yang dikultivasi pada medium GYP yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff. 27 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Berdasarkan profil KLT yang ditunjukkan pada Gambar 4.1 dengan penyemprotan penampak noda serium sulfat dapat diketahui bahwa pada 12 ekstrak etil asetat:metanol 4:1 kultur jamur mengandung beberapa senyawa kimia yang merupakan hasil bioproduksi metabolit sekunder hasil kultivasi tahap pertama dari 6 isolat jamur pada 2 medium yaitu medium PDB dan GYP. Sedangkan, hasil identifikasi dengan pereaksi Dragendorff menunjukkan tidak terdapatnya senyawa alkaloid munculnya noda warna jingga pada 12 ekstrak kultur jamur tersebut. Selain itu, digunakan juga kontrol medium PDB dan GYP yang diekstrak dengan cara yang sama yang menunjukkan tidak adanya spot pada hasil uji KLT. Hal ini dikarenakan tidak terjadinya bioproduksi metabolit sekunder pada medium PDB dan GYP tanpa kultur jamur. Kultivasi tahap kedua dilakukan terhadap 4 isolat jamur isolat no. 7-10 yang kemudian diekstraksi secara partisi menggunakan corong pisah dengan pelarut etil asetat:metanol 4:1 sebanyak 3x40 mL. Dari hasil ekstraksi diperoleh 2 fraksi yaitu fraksi etil asetat:metanol lapisan atas yang kemudian dipekatkan menggunakan vacuum rotary evaporator dan fraksi air lapisan bawah yang kemudian diekstraksi kembali dengan pelarut klroform sebanyak 3x40 mL. Proses ekstraksi dengan menggunakan pelarut kloroform ini bertujuan untuk mengekstraksi senyawa alkaloid yang biasanya terdapat pada tanaman Kina. Selain itu, senyawa alkaloid juga termasuk ke dalam senyawa antimikroba yang telah diisolasi dari jamur endofit Yu et al., 2010. Pemilihan pelarut kloroform ini berdasarkan pada daya larutnya yang tinggi untuk melarutkan senyawa alkaloid Sarker et al.,2005. Dari proses ekstraksi ini diperoleh 16 ekstrak kultur jamur yang kemudian ditimbang dan dibuat konsentrasi 10 mgmL dengan cara melarutkannya dalam metanol dengan jumlah tertentu sesuai dengan masing- masing bobot ekstrak pekat yang diperoleh. Data bobot masing-masing ekstrak yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 4.1. 28 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 4.1 Data bobot ekstrak kultur jamur endofit No Kode Isolat Bobot Ekstrak Jamur mg Medium PDB Bobot Ekstrak Jamur mg Medium GYP Ekstrak Etil Asetat:MetOH 4:1 Ekstrak Kloroform Ekstrak Etil Asetat:MetOH 4:1 Ekstrak Kloroform 1 5-1-8-5 25,0 - 12,5 - 2 1-2-5-3 20,2 - 14,8 - 3 2-2-6-4 23,0 - 16,5 - 4 3-2-10-2 13,1 - 10,0 - 5 2-3-4-2 10,2 - 15,9 - 6 3-3-4-2 20,2 - 29,2 - 7 1-2-4-4 126,8 1,9 35,2 5,3 8 1-2-6-3 86,3 2,0 31,1 5,5 9 3-2-1-2 21,4 1,1 13,2 0,9 10 1-3-1-1 31,2 1,0 93,2 7,1 Keterangan : - Tidak dilakukan Masing-masing ekstrak diidentifikasi dengan KLT, sebagai proses awal digunakan eluen diklorometan:metanol 7:1, diamati dibawah sinar UV 254 nm dan UV 366 nm dan disemprot dengan penampak noda serium sulfat yang bertujuan untuk melihat adanya metabolit sekunder dari masing-masing ekstrak. Pada plat KLT yang berbeda, dilakukan juga identifikasi terhadap masing-masing ekstrak dengan menggunakan pereaksi Dragendorff yang bertujuan untuk mendeteksi adanya senyawa alkaloid. Profil KLT dari 16 ekstrak yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat dan pereaksi Dragendorff dapat dilihat pada Gambar 4.2 29 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta a b c d e f g h Gambar 4.2 Profil KLT dari 16 ekstrak yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat dan pereaksi Dragendorff Eluen : diklorometan:metanol 7:1 Keterangan: a Ekstrak etil asetat:metanol 4:1 kultur jamur pada medium PDB yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat b Ekstrak etil asetat:metanol 4:1 kultur jamur pada medium PDB yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff c Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium PDB yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat d Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium PDB yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff e Ekstrak etil asetat:metanol 4:1 kultur jamur pada medium GYP yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat f Ekstrak etil asetat:metanol 4:1 kultur jamur pada medium GYP yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff 30 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta g Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium GYP yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat h Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium GYP yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff Berdasarkan profil KLT yang ditunjukkan pada Gambar 4.2 dengan penyemprotan penampak noda serium sulfat dapat diketahui bahwa pada 8 ekstrak etil asetat:metanol 4:1 dan 8 ekstrak kloroform kultur jamur mengandung beberapa senyawa kimia yang merupakan hasil bioproduksi metabolit sekunder hasil kultivasi tahap kedua dari 4 isolat jamur pada 2 medium yaitu medium PDB dan GYP. Hasil identifikasi dengan pereaksi Dragendorff menunjukkan bahwa pada ekstrak kloroform no. 10 d, 7 h, 8 h, 9 h, dan 10 h menunjukkan adanya senyawa alkaloid munculnya noda warna jingga. Untuk mengetahui adanya aktivitas antibakteri pada masing-masing ekstrak maka dilakukan uji bioautografi. Uji bioautografi ini merupakan suatu metode yang menggabungkan penggunaan teknik kromatografi lapis tipis dengan respon dari mikroorganisme yang diuji berdasarkan aktivitas biologi dari suatu analit yang dapat berupa antibakteri, antijamur, antitumor, antriprotozoa Choma, 2005. Keuntungan metode bioautografi ini yaitu sifatnya yang efisien untuk mendeteksi adanya senyawa antimikroba karena letak bercak dapat ditentukan walaupun berada dalam campuran yang kompleks sehingga memungkinkan untuk mengisolasi senyawa aktif tersebut Pratiwi, 2008. Dalam uji aktivitas antibakteri ini digunakan 2 bakteri uji, yaitu bakteri Staphylococcus aureus dan bakteri Escherichia coli yang telah diidentifikasi secara mikroskopis dengan metode pewarnaan Gram. Gambar hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 6. S. aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk kokus bulat yang merupakan penyebab berbagai infeksi pada manusia dan hewan Pelczar Chan, 1986; Todar, 2002. Sedangkan E. coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk basil batang yang merupakan mikroflora normal dalam tubuh manusia akan tetapi pada galur-galur tertentu dapat menyebabkan penyakit pada manusia dan hewan Pelczar Chan, 1986; Holt et al., 1994. 31 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Uji aktivitas antibakteri ini menggunakan metode bioautografi langsung, dimana plat KLT yang telah ditotolkan dengan 10 µL dari masing-masing ekstrak yang memiliki konsentrasi 10 mgmL, dicelupkan kedalam suspensi bakteri uji. Setelah diinkubasi pada suhu 37 C selama 18 jam, plat KLT disemprot dengan reagen warna INT secara merata yang bertujuan untuk mewarnai adanya bakteri yang masih hidup. Hal ini terjadi karena adanya reaksi enzimatik yang mengubah garam tetrazolium menjadi formazan yang berwarna merah, sehingga akan dihasilkan zona hambat yang tidak berwarna jika spot ekstrak bersifat aktif sebagai antibakteri. Gambar 4.3 Reaksi garam tetrazolium kuning menjadi formazan merah Senoz, 2012 Hasil identifikasi terhadap aktivitas antibakteri dari 28 ekstrak kultur jamur dengan bakteri uji S. aureus dan E. coli dapat dilihat pada Gambar 4.4 dan Gambar 4.5. Garam Tetrazolium Formazan H + 32 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta a b e Gambar 4.4 Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur dengan bakteri uji S. aureus a b e Gambar 4.5 Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur dengan bakteri uji E. coli Keterangan: a Ekstrak etil asetat kultur jamur pada medium PDB b Ekstrak etil asetat kultur jamur pada medium GYP c Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium PDB d Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium GYP c d d c 33 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta e Kontrol positif antibiotik kloramfenikol 5 µg kiri dan 10 µg kanan Dari hasil uji bioautografi ini, dapat diketahui bahwa ekstrak kultur jamur endofit yang memiliki aktivitas antibakteri yaitu ekstrak no. 9 isolat 3-2-1-2 dan no. 10 isolat 1-3-1-1 yang dikultivasi pada medium PDB dan diekstraksi dengan pelarut kloroform. Diameter zona hambat ekstrak no. 10 S. aureus : 0,9 cm dan E. coli : 0,8 lebih besar daripada ekstrak no. 9 S. aureus : 0,6 cm dan E. coli : 0,6 cm, sehingga dapat dikatakan bahwa jamur endofit no. 10 memiliki aktivitas antibakteri lebih besar daripada jamur endofit no. 9. Selanjutnya dilakukan scaling up terhadap kultur jamur endofit no. 10 pada medium PDB.

4.2 Scaling Up Jamur Endofit No. 10 Isolat 1-3-1-1 pada Medium PDB

Berdasarkan hasil skrining, diketahui bahwa ekstrak kloroform kultur jamur endofit no. 10 yang dikultivasi pada medium PDB memiliki aktivitas sebagai antibakteri yang paling besar terhadap bakteri uji S. aureus dan E. coli. Maka, dilakukan scaling up terhadap kultur jamur endofit no. 10 agar metabolit bioaktif yang diperoleh lebih banyak dan mencukupi untuk dilakukan uji selanjutnya. Proses scaling up ini dilakukan pada medium PDB sebanyak 2 liter dengan masa kultivasi selama 3 minggu. Kultur jamur endofit hasil scaling up diekstraksi secara ekstrasel dan intarsel yaitu dengan cara memisahkan antara medium dengan biomassanya dengan cara disaring. Medium diekstraksi dengan pelarut kloroform, sedangkan untuk biomassa dilakukan maserasi dengan aseton sebanyak 3x24 jam. Hasil maserasi diekstraksi dengan kloroform. Semua proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut sebanyak 1:1 terhadap fraksi air kultur jamur dan dilakukan sebanyak 3 kali. Hal ini bertujuan agar diperoleh ekstrak sebanyak mungkin. Masing-masing fraksi yang didapat dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Selanjutnya dilakukan uji KLT-bioautografi pada ekstrak kloroform medium jamur dan ekstrak kloroform biomassa jamur dengan konsentrasi masing- masing ekstrak 10 mgmL yang ditotolkan pada plat KLT sebanyak 10 µL dengan pipa kapiler, dikembangkan dengan eluen diklorometan:metanol 15:1 yang bertujuan untuk mengetahui nilai Rf dari senyawa yang aktif sebagai antibakteri. 34 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Profil KLT-bioautografi ekstrak kultur jamur endofit no.10 hasil scaling up dapat dilihat pada Gambar 4.6. a b c Gambar 4.6 Profil KLT-bioautografi ekstrak kultur jamur no. 10 isolat 1-3-1-1 hasil scaling up Eluen diklorometan:metanol 15:1 Keterangan : a Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur no.10 dengan bakteri uji S. aureus b Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur no. 10 dengan bakteri uji E. coli c Hasil uji KLT ekstrak kultur jamur no. 10 yang disemprot dengan pereaksi penampak noda serium sulfat MC : Ekstrak kloroform medium jamur no.10 BC : Ekstrak kloroform biomassa jamur no.10 Berdasarkan hasil uji KLT-bioautografi pada kedua ekstrak, dapat diketahui bahwa zona hambat pada spot ekstrak kloroform biomassa jamur lebih besar daripada ekstrak kloroform medium jamur. Zona hambat yang terlihat pada ekstrak kloroform biomassa jamur memiliki nilai Rf 0,18-0,78 bakteri uji S. aureus dan nilai Rf 0,25-0,72 bakteri uji E. coli. Sedangkan untuk ekstrak kloroform medium jamur memiliki nilai Rf 0-0,53 bakteri uji S. aureus dan nilai Rf 0,42-0,68 bakteri uji E. coli. Tahap selanjutnya dilakukan fraksinasi dan purifikasi metabolit bioaktif antibakteri dari ekstrak kloroform biomassa jamur.