22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.4.2 Persiapan Larutan Uji
Larutan uji yang digunakan yaitu fraksi 3e. Larutan uji dibuat konsentrasi 512 µgmL dengan menggunakan pelarut DMSO 30. Fraksi 3e 1,4 mg
dilarutkan dalam 1,4 mL metanol, kemudian dipipet sebanyak 512 µL ke dalam vial dan dikeringkan dengan nitrogen. Setelah itu, dilarutkan dengan pelarut
DMSO 30 DMSO 300 µL dan aquabidest 700 µL.
3.4.4.3 Persiapan Bakteri Uji
Bakteri uji yang digunakan yaitu S. aureus dan E. coli. Persiapan bakteri uji terdiri dari:
a Pembuatan suspensi bakteri Sebanyak 1 ose isolat bakteri diinokulasikan ke dalam 20 mL medium
MHB. Kemudian diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 37
C selama 18 jam. b Pengenceran suspensi bakteri
Suspensi bakteri uji diencerkan untuk mempermudah perhitungan koloni, yaitu dengan cara dipipet 50 µL suspensi bakteri ke dalam 4.950 µL aquadest
steril sehingga didapat pengenceran 10
-2
, dari suspensi bakteri pengenceran 10
-2
dipipet 50 µL ke dalam 4.950 µL aquadest steril sehingga didapat pengenceran 10
-4
. Suspensi tersebut diencerkan lagi dengan cara yang sama hingga didapat suspensi dengan pengenceran 10
-6
, 10
-8
, dan 10
-10
. c Perhitungan jumlah koloni bakteri
Suspensi dengan faktor pengenceran 10
-6
, 10
-8
, dan 10
-10
, diinokulasikan sebanyak 100 µL kedalam medium MHA, disebarkan menggunakan spreader.
Kemudian diinkubasi dalam incubator pada suhu 37 C selama 18 jam. Koloni
bakteri yang muncul dihitung Lampiran 5.
Jumlah koloni bakteri = Koloni yang muncul x faktor pengenceran
Volume yang dipipet
23
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
d Pengenceran bakteri untuk uji KHM Stok bakteri yang digunakan untuk uji KHM dibuat dengan cara
mengencerkan suspensi bakteri awal menjadi 10
5
CFUmL berdasarkan hasil dari perhitungan jumlah koloni bakteri yang digunakan Lampiran 5.
3.4.4.4 Pengenceran Larutan Uji
Pengenceran larutan uji dari konsentrasi 512 µgmL menjadi 128 µgmL, 64 µgmL, 32 µgmL, 16 µgmL, 8 µgmL, 4 µgmL, dan 1 µgmL menggunakan
96 well microtiter plate dengan komposisi sebagai berikut: a Sumur A1-A9 diisi dengan 100 µL medium MHB 2.
b Sumur B1-H9 diisi dengan 100 µL medium MHB 1. c Sumur A1-A3 diisi dengan 100 µL sampel uji.
d Sumur A4-A6 diisi dengan 100 µL eritromisin antibiotic control. e Sumur A7-A9 diisi dengan 100 µL kloramfenikol antibiotic control.
f Dari sumur A1-A9 masing-masing diambil 100 µL dan dimasukkan dalam sumur B1-B9, begitu seterusnya sampai sumur H1-H9. Pada sumur H1-H9
diambil 100 µL dan dibuang. g Sumur A10 diisi 200 µL dengan medium MHB 2 sterility control.
h Sumur B10 diisi 200 µL dengan medium MHB 1 sterility control. i Sumur C10-D10 diisi 100 µL dengan medium MHB 1 growth control.
j Sumur E10-F10 diisi 100 µL dengan medium MHB 2 dan 100 µL DMSO 30 dan dibuang 100 µL solvent control.
k Sumur G10-H10 diisi 100 µL dengan medium MHB 2 dan 100 µL etanol 30 dan dibuang 100 µ L solvent control.
l Masing-masing sumur ditambah dengan bakteri uji 100 µL kecuali sumur untuk sterilitiy control.
3.4.4.5 Inkubasi Microtiter Plate yang Berisi Sampel Uji
Microtiter plate yang berisi sampel uji diinkubasi dalam incubator pada suhu 37
C selama 18 jam.
Kategori