19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
d Uji Bioautografi
Plat KLT yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam suspensi bakteri uji dan diinkubasi pada suhu 37
C selama 18 jam, kemudian disemprot dengan pereaksi warna INT 4 mgmL dan diinkubasi selama 1 jam. Keberadaan
aktivitas antibakteri ditentukan dengan terbentuknya zona hambat yang tampak karena penyemprotan INT yang dikonversikan terhadap warna formazan pada
mikroorganisme hidup.
3.4.2 Scaling up Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai Antibakteri pada
Medium PDB 3.4.2.1 Pembuatan Medium Kultivasi
Medium PDB dibuat sebanyak 2 Liter dengan komposisi 24 gram PDB dalam 1 Liter aquadest. Setelah semua komponennya larut, medium dibagi ke
dalam 4 erlenmeyer berukuran 2 Liter yang masing-masingnya diisi 500 mL. Medium tersebut disterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121
C.
3.4.2.2 Kultivasi Jamur Endofit
Berdasarkan hasil skrining antibakteri, ekstrak kultur jamur yang paling aktif sebagai antibakteri yaitu ekstrak kloroform dari isolat jamur endofit no. 10
isolat 1-3-1-1 yang dikultivasi pada medium PDB. Isolat yang telah diregenerasi pada medium PDA diambil sebanyak ±3 ose dan diinokulasikan ke dalam 4x500
mL medium PDB yang sudah steril. Proses inokulasi ini dilakukan secara steril dalam laminar air flow. Setelah itu, kultur jamur endofit diinkubasi pada suhu
ruang selama 3 minggu.
3.4.2.3 Ekstraksi Kultur Jamur Endofit Hasil Scaling Up
Hasil kultivasi jamur endofit no.10 isolat 1-3-1-1 dipisahkan antara medium dan biomassanya dengan cara disaring. Medium diekstraksi dengan
pelarut kloroform sebanyak 2 Liter dengan perbandingan 1:1 terhadap jumlah medium, sedangkan untuk biomassa dimaserasi terlebih dahulu dengan aseton
3x24 jam, diuapkan asetonnya menggunakan vacuum rotary evaporator sehingga didapat fraksi air yang kemudian diekstraksi dengan pelarut kloroform dengan
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
perbandingan 1:1 terhadap jumlah fraksi airnya. Proses ekstraksi ini dilakukan secara berulang sebanyak 3 kali. Lapisan bawah yang merupakan fraksi kloroform
dari medium dan biomassa jamur dipisahkan dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Ekstrak pekat yang didapat dilarutkan dengan metanol dan
dilakukan uji KLT dengan menggunakan fase gerak diklorometan:metanol 15:1 dan hasilnya diamati dibawah sinar UV 254 nm dan UV 366 nm serta disemprot
dengan pereaksi penampak noda serium sulfat.
3.4.2.4 Uji KLT-Bioautografi Ekstrak Jamur Endofit Hasil Scaling Up
Berdasarkan proses ekstraksi pada kultur jamur endofit no. 10 isolat 1-3-1-1 hasil scaling up, didapat 2 ekstrak sampel yaitu: ekstrak kloroform
medium jamur dan ekstrak kloroform biomassa jamur. Ekstrak tersebut dibuat konsentrasi menjadi 10 mgmL, kemudian sebanyak 10 µL dari masing-masing
ekstrak ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada plat KLT dan dielusi menggunakan pelarut diklorometan:metanol 15:1. Setelah itu, plat KLT
dicelupkan kedalam suspensi bakteri uji dan diinkubasi pada suhu 37 C selama
18 jam. Plat KLT yang telah diinkubasi disemprot dengan reagensia pewarna INT 4 mgmL dan diinkubasi selama 1-2 jam. Selanjutnya dilakukan penghitungan
nilai Rf Retardation factor terhadap senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri. Keberadaan aktivitas antibakteri ditentukan dengan terbentuknya zona
hambat yang tampak karena penyemprotan INT yang dikonversikan terhadap warna formazan pada mikroorganisme hidup.
3.4.3 Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri
Berdasarkan hasil pengamatan uji KLT-bioautografi, selanjutnya dilakukan fraksinasi dan purifikasi metabolit bioaktif dari ekstrak kloroform
biomassa jamur 161,7 mg dengan kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel 70-230 mesh dan fase gerak kloroform:metanol 30:1. Fase diam
disuspensikan kedalam fase gerak eluen kemudian dimasukkan secara perlahan melalui corong ke dalam kolom yang telah diisi kapas dan seasand di bagian
bawah kolom. Untuk penyempurnaan proses pemisahan, fase diam dipadatkan dengan cara menurunkan fase gerak serta dinding kolom diketok-ketok secara
