kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100
o
C. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 mL yang berisi campuran 10 mL asam
borat H
3
BO
3
2 dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah volume destilat mencapai 40 mL dan berwarna
hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca
dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Kadar nitrogen dihitung dengan rumus sebagai berikut :
N = mL HCl – mL blanko x N HCl x 14,007 x faktor pengenceran x 100
mg contoh x faktor koreksi alat Faktor koreksi alat = 2,5
Kadar protein = N x 6.25 Faktor pengenceran= 10
3.4.4 Analisis pengukuran derajat deasetilasi Domszy dan Robert 1985
Kitosan sebanyak 0,2 gram digerus dengan KBr dalam mortar sampai homogen, kemudian dimasukkan dalam cetakan pelet, dicetak dengan dipadatkan
dan divakum sampai optimum. Selanjutnya pelet ditempatkan dalam sel dan dimasukkan ke dalam tempat sel pada spektrofotometer inframerah IR-408 yang
sudah dinyalakan dan stabil kemudian dilakukan penekanan tombol pendeteksian, sehingga akan muncul histogram FTIR pada rekorder yang memunculkan puncak-
puncak dari gugus fungsi yang terdapat pada sampel kitosan. Histogram yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif misalnya
analisis kuantitatif derajat deasetilasi dari kitosan. Pengukuran derajat deasetilasi berdasarkan kurva yang tergambar oleh
spektrofotometer. Puncak tertinggi P dan puncak terendah P dicatat dan
diukur dengan garis dasar yang dipilih. Nisbah absorbansi dihitung dengan rumus:
Keterangan: P
= Jarak antara garis dasar dengan garis singgung antara dua puncak tertinggi dengan panjang gelombang 1.655 cm
-1
atau 3.450 cm
-1
. A = Log P
P
P = Jarak antara garis dasar dengan lembah terendah dengan panjang gelombang 1.655 cm
-1
atau 3.450 cm
-1
. Perbandingan absorbansi pada 1.655 cm
-1
dengan absorbansi 3.450 cm
-1
digandakan satu per standar N-deasetilasi kitosan 1,33. Dengan mengukur absorbansi pada puncak yang berhubungan, nilai persen N-deasetilasi dapat
dihitung dengan rumus:
Keterangan: A
1.655
= Absorbansi pada panjang gelombang 1.655 cm
-1
. A
3.450
= Absorbansi pada panjang gelombang 3.450 cm
-1
. 1,33 = konstanta untuk derajat deasetilasi yang sempurna.
3.4.5 Analisis pengujian antibakteri kitosan Lalitha 2004
. Uji ini meliputi persiapan media cair, persiapan media padat dan prosedur
aktivitas antibakteri. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dnegan metode difusi agar Kirby bauer menggunakan kertas cakram paper disc.
a. Persiapan media cair
Penyegaran bakteri uji refresh bakteri yaitu menggunakan media NB nutrient broth. NB Oxoid ditimbang sebanyak 0,72 gram lalu dilarutkan ke
dalam 60 ml akuades, media tsb dihomogenkan menggunakan hotplate pada suhu 100
o
C. Media yang telah homogen dimasukkan sebanyak 9 ml ke dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup menggunakan kapas dan aluminium foil.
Media tersebut disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit. Media didinginkan di tempat yang steril pada suhu ruang.
b. Persiapan media padat
Media padat yang digunakan adalah MHA muller hinton agar . Media MHA dibuat dengan cara melarutkan 38 MHA ke dalam akuades. Larutan
tersebut dihomogenkan menggunakan hotplate pada suhu 100
o
C. Larutan kemudian dipipet 20 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan masing-
masing tabung ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil. Media tersebut disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit. Media didiamkan
dalam laminar aseptik sampai agar beku. Apabila media sudah beku, media disimpan dalam refrigerator.
c. Persiapan suspensi bakteri
Sebanyak satu ose bakteri uji dimasukkan ke dalam media cair NB yang telah dingin secara aseptik, kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C 18-24 jam. Biakan bakteri yang telah diinkubasi tersebut diukur rapat optis atau OD optical
density nya dengan nilai antara 0,5-0,8 pada panjang gelombang 600 nm. d.
Pengujian antibakteri Tahap pertama pada uji aktivitas antibakteri ini adalah meneteskan larutan
kitosan dengan konsentrasi 0,5 , 1,0 , dan 1,5 pada setiap paper disc sebanyak 20 mikroliter sehingga didapat konsentrasi larutan kitosan per paper
disc dengan menggunakan pipet mikro. Paper disc yang telah berisi larutan kitosan dibiarkan sampai mengering atau pelarutnya menguap dalam laminar
steril. Tahap selanjutnya, sebanyak 20 ml media MHA dalam keadan cair
ditambahkan 20 mikroliter bakteri uji yang telah diukur OD menggunakan pipet mikro. Media agar yang telah ditambahkan bakteri uji dihomogenkan dengan
vortex, kemudian segera dituangkan ke dalam cawan petri steril dan digoyangkan membentuk angka delapan agar bakeri menyebar dan media MHA tercampur
merata. Media agar terebut didiamkan dalam laminar aseptik selama 15 menit atau sampai agar beku.
Apabila media MHA tersebut telah membeku, masing-masing paper disc diletakkan dalam cawan petri berisi agar dan bakteri dengan menggunakan
pinset steril. Cawan tersebut kemudian diinkubasi dalam keadaan terbalik dalam waktu 18-20 jam dengan suhu 37
o
C. aktivitas antibakteri dapat dilihat dengan mengamati zona hambatan yang terbentuk di sekeliling paper disc. Antibakteri
dikatakan positif jika terbentuk zona hambatan berupa zona bening di sekeliling paper disc dan antibakteri negatif ditandai dengan tidak terbentuknya zona
bening. Diameter zona hambat yang terbentuk diukur lebarnya menggunakan penggaris atau jangka sorong. Besar diameter zona hambat dihitung dengan cara
mengurangi diameter zona hambat yang terbentuk pada cawan petri uji dengan diameter paper disc.
3.4.6 Uji total plate count TPC Fardiaz 1992
