Identifikasi Variabel .1 Variabel Bebas

28 ml KOH 40 , kemudian digoyang-goyang.Hasil reaksi positif ditandai adanya warna merah muda eosin dalam waktu 2 jam. 23

3.4.2.3 Uji Methyl Red MR

Ambil biakan dari media EMB agar lalu inokulasikan ke tabung yang berisi 10 ml media MR-VP dan inkubasikan pada temperatur 35 °C selama 48 jam ± 2 jam. Tambahkan 2 tetes sampai dengan 5 tetes indikator MR pada tabung. Hasil uji positif ditandai adanya warna merah dan hasil reaksi negatif ditandai adanya warna kuning. 23

3.4.2.4 Uji Sitrat

Inokulasikan koloni dari media EMB agar ke dalam media agar miring sitrat, dan inkubasikan pada temperatur 35 °C selama 96 jam. Hasil uji positif ditandai dengan terbentuknya kekeruhan pada media. 23

3.4.2.5 Uji Gula-Gula

Inokulasikan koloni dari EMB agar sebanyak 1 ose pada tabung uji gula-gula dan inkubasikan selama 24jam. Hasil uji positif ditandai dengan perubahan warna larutan uji menjadi kuning dan disertai pembentukan gas pada tabung durham. 23

3.4.2.6 Pewarnaan Gram

Siapkan objek glass yang bersih. Lalu buatlah preparat ulas smear yang telah difiksasi dari EMB agar yang diduga E. coli. Kemudian teteskan zat pewarna primer ungu kristal violet, usahakan semua ulasan terwarnai dan tunggu selama ± 4 menit, kemudian cuci dengan air mengalir.Teteskan mordantlugol’s iodine lalu tunggu ± 1menit, kemudian cuci dengan air mengalir. Lalu beri larutan pemucat etanol 96 setetes demi setetes hingga etanol yang jatuh berwarna jernih. Jangan sampai terlalu banyak overdecolorized, kemudian cuci dengan air mengalir. Teteskan counterstain safranin dan tunggu selama ± 45 detik, kemudian 29 cuci dengan air mengalir.Keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi belakang ulasan jangan sampai merusak ulasan lalu biarkan mengering di udara. Hasil pewarnaan bakteri Gram negatif akan berwarna merah dan bakteri Gram positif berwarna ungu. Apabila hasil pewarnaan menunjukkan Gram negatif, amati morfologi dan lanjutkan dengan melakukan uji IMVIC dan uji gula-gula.. Jika kultur dugaan tersebut E. coli maka akan menunjukkan sifat Gram negatif dan morfologi sel berbentuk batang pendek. 23 3.4.3 Alat dan Bahan Penelitian 3.4.3.1 Alat Penelitian

a. Tahap pengujian MPN

Alat yang digunakan dalam tahapan ini yaitu: tabung reaksi, tabung durham, gelas kimia, mikropipet, botol sampel, pinset, pembakar bunsen, timbangan, magnetic stirer; inkubator, penangas air, autoklaf, lemari pendingin refrigerator, plastik tahan panas, rak tabung, tissue, karet, kapas, spidol, label, alkohol swab, laminar air flow. b. Penanaman ke Media selektif Alat yang digunakan yaitu bunsen,korek,laminar air flow, jarum inokulasi ose bulat, label, spidol, inkubator, lemari es. c. Pewarnaan Gram Alat yang digunakan antara lain glass objek, bunsen,jarum inokulasi ose bulat, rak pewarnaan, botol aquadest, tissue, bunsen,korek, spidol, mikroskop.

d. Uji biokimia

Alat yang digunakan yaitu tabung reaksi,laminar air flow, label, spidol, rak tabung reaksi, inkubator, bunsen,korek, jarum inokulasi ose bulat dan jarum.