Pada daerah yang tidak dilakukan surveilans influenza rekomendasi WHO adalah:
30
• Pada daerah yang tidak diketahui aktifitas influenza
penggunaan rapid test untuk diagnosis tidak
direkomendasikan. •
Jika rapid test digunakan, hasil positif atau negatif harus dikonfirmasi dengan IFA, kultur virus atau RT-PCR.
2.16 Prinsip Dasar Polymerase Chain Reaction PCR
Polymerase Chain Reaction adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Proses tersebut mirip dengan proses
replikasi DNA di dalam sel. Polymerase Chain Reaction membutuhkan templat untai DNA ganda yang mengandung DNA
target yang diamplifikasi, enzim DNA polimerase, nukleotida trifosfat dan sepasang primer oligonukleotida. Untuk merancang urutan
primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada awal dan akhir DNA target. Primer oligonukleotida tersebut disintesis menggunakan alat
yang disebut DNA synthesizer. Pada kondisi tertentu, kedua primer menempel pada untai DNA komplemennya yang terletak pada awal
dan akhir DNA target. Kedua primer tersebut masing-masing mengenali kedua untai DNA dan berfungsi menyediakan gugus
hidroksil bebas pada karbon. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan
Universitas Sumatera Utara
kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templatnya.
32,36
PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu denaturasi templat, penempelan
pasangan primer pada untai ganda DNA target dan pemanjangan primer. Denaturasi DNA templat pada siklus pertama dilakukan pada
temperatur 94-100°C untuk memisahkan kedua untai DNA genom secara sempurna, sehingga kedua primer menempel setelah
penurunan temperatur. Untuk siklus selanjutnya, denaturasi dilakukan pada temperatur 90-95°C tetapi optimalisasi perlu
dilakukan untuk reaksi thermocycler dan tabung reaksi berbeda. Pada tahap kedua, temperatur diturunkan sampai 37-60°C
tergantung pada primer yang digunakan sehingga kedua primer menempel pada untai DNA target. Tahap ini menentukan spesifisitas
PCR. Setelah primer menempel pad DNA target, DNA polimerase mengkatalisis penambahan nukleotida yang biasanya dilakukan pada
temperatur 72°C, yang merupakan temperatur optimum untu TaqAmplitaq DNA polimerase. Lama tahap pemanjangan tergantung
pada panjang DNA yang diamplifikasi. Seringkali tahap pemanjangan terakhir dilakukan lebih lama sampai 10 menit untuk menjamin agar
semua molekul produk amplifikasi telah dipanjangkan secara sempurna.
34,36
Universitas Sumatera Utara
Pada akhir siklus pertama, target DNA jumlahnya menjadi dua kali lebih banyak ari jumlah semula. Siklus diulangi kembali, dimulai
dengan tahap denaturasi, penempelan dan pemanjangan primer. Produk hasil sintesis pada akhir setiap siklus berfungsi sebagai
templat dalam siklus selanjutnya, sehingga fragmen DNA diamplifikasi secara eksponensial. Jumlah siklus biasanya antara 25
dan 35, tetapi umumnya 30. Jumlah siklus lebih dari 35 tidak menaikkan jumlah produk yang tidak spesifik. Pad akhir PCR
diperoleh amplifikasi sebanyak 10
6
– 10
9
kali jumlah DNA target awal.
34,36
Untuk mengaplikasi RNA digunakan suatu tehnik yang melibatkan transkripsi balik reverse transcription dan PCR. RNA
pertama-tama diubah terlebih dahulu menjadi DNA menggunakan suatu enzim yang mengkatalisis sintesis DNA dari RNA reverse
transcriptase. Secara keseluruhan metode ini disingkat menjadi RT- PCR. Setelah DNA terbentuk disebut cDNA maka DNA tersebut
diamplifikasi dengan enzim DNA polimerase. PCR mengamplifikasi DNA, maka patogen yang mati dapat memberikan hasil positif. RT-
PCR yang ditujukan untuk mengamplifikasi RNA mRNA, tRNA, dan rRNA hanya memberikan hasil positif bila patogen hidup. Hal ini
disebabkan karena kestabilan mRNA, tRNA, dan rRNA yang relatif rendah dibandingkan dengan DNA. RT-PCR juga dapat digunakan
untuk mendeteksi virus bergenom RNA.
33,34,35
Universitas Sumatera Utara
2.17 Prosedur Pengambilan dan Pengiriman Sampel PCR
