Prosedur Pengambilan dan Pengiriman Sampel PCR

2.17 Prosedur Pengambilan dan Pengiriman Sampel PCR

Pasien yang memenuhi kriteria inklusi, dianamnesis untuk mengisi selembar kuesioner yang berisi sedikit data pribadi, gejala penyakit sekarang, riwayat berobat dan apakah terdapat riwayat kontak dengan unggas. Dokter kemudian mengambil apus hidung dan apus tenggorok dari pasien, mengikuti prosedur sebagai berikut : 1. Pertama-tama disiapkan alat-alatnya berupa: 3 buah vial berwarna merah muda yang berisi media transport untuk pertumbuhan virus media Hanks’ Balance Salt SolutionHBSS, 3 tangkai swablidiwaten, sarung tangan,penekan lidah dan perlengkapan untuk keamanan untuk sarung tangan dan masker bila diperlukan. Tempelkan stiker pada setiap vial, dan tuliskan nama pasien, jenis apus yang diambil hidung1, hidung2, atau tenggorok, serta tanggal pengambilan apus ini. 2. Apus yang pertama diambil adalah apus hidung1. Pakailah sarung tangan, dan buka pembungkus swab pertama. Usapkan swab tersebut pada lubang hidung kanan perlahan- lahan sampai sekitar kartilago lateral atas 2-3 cm dari ujung swab, masukkan swab tersebut pada vial pertama hidung1 dan putuskan tangkainya sehingga vial tersebut dapat ditutup. 3. Kemudian lakukan hal yang sama seperti 2 pada hidung sebelah kiri dan masukkan pada vial yang berlabel hidung2. Universitas Sumatera Utara 4. Kemudian dilakukan pengambilan sampel dari tenggorokan. Siapkan swab ke 3. Instruksikan pasien untuk membuka mulutnya, dan mengucapkan “aaaa” panjang. Tekanlah secara lembut lidah pasien, sehingga rongga mulut dapat terlihat dengan baik. Usapkan swab pada daerah peritonsiler atau tonsil kiri dan kanan terlebih dahulu, kemudian diakhiri dengan pharynx. Masukkan swab pada vial untuk tenggorok.Jika sebelum lengkap pengusapan ini pasien terangsang refleks muntahnya, pengambilan sampel dapat diulang kembali untuk tempat yang belum dilaksanakan setelah pasien siap. Masukkan sampel ke dalam vial yang telah dilabel untuk tenggorokan, kemudian ditutup. 5. Perhatikan apakah semua vial sudah diberi label dan dilengkapi, serta lembaran kuesioner telah diisi. Simpanlah semua sampel pada kulkas dibagian bawah 2-8 C, atau jika ada disimpan di revco -70 C atau nitrogen cair -196 C yang telah disiapkan. Sampel yang digunakan untuk pemeriksaan cepat seperti dijelaskan pada prosedur pemeriksaan sampel adalah sampel yang berasal dari vial hidung1. 6. Sampel-sampel tersebut setiap minggu dimasukkan dalam styroform yang telah disediakan dan disusun sedemikian rupa sehingga sampel tersebut dikelilingi oleh 4 buah “ice-packs” di dalam styroform atau jika memungkinkan menggunakan es Universitas Sumatera Utara kering.Tutuplah sealed styroform tersebut dengan rapat, dan kirimkan setiap hari senin setiap minggu ke Bagian Virologi NAMRU-2, JAKARTA. Jl Percetakan Negara no 29, Jakarta. 1. Prosedur Pemeriksaan sampel Pemeriksaan yang akan dilakukan pada sampel tersebut adalah : a. Pemeriksaan dilakukan menggunakan sampel hidung1. Prinsip dari pemeriksaan ini adalah antigen virus Influenza A tau B yang terdapat pada sampel akan dideteksi oleh antibodi yang telah ditempatkan pada kit lubang atas: antibodi terhadap berbagai galur influenza A, dan lubang bawah antibodi terhadap berbagai galur influenza B. Berdasarkan data di NAMRU-2 Sentifitas kit ini hanyalah sekitar 50-60 saja, dengan spesifisitas hampir mencapai 100, sehingga perlu diingat bahwa hasil negatif tidak berarti bahwa penderita tersebut pasti tidak terkena influenza, sementara itu hasil positif menunjukkan kemungkinan besar penderita tersebut benar-benar terkena influenza. Hasil pemeriksaan dituliskan pada lembaran kuesioner. b. Pemeriksaan untuk mendeteksi RNA virus influenza menggunakan metoda Reverse-trancriptase Polymerase Universitas Sumatera Utara Chain Reaction RT-PCR Dilakukan terhadap semua sampel baik dari hidung maupun sampel tenggorok. Saat ini semua sampel tersebut akan diperiksa terlebih dahulu untuk Influenza A H5N1 Influenza burung, atau subtype lain dari flu burung untuk skrining sampai dipastikan tidak ada lagi resiko dari flu burung. Jika sampel tersebut terbukti negatif, akan dilanjutkan dengan pemeriksaan untuk influenza A H1N1, Influenza A H3N2 dan Influenza B dan isolasi serta identifikasi 4c. Secara ringkas, langkah-langkah pemeriksaan dengan metoda RT-PCR adalah sebagai berikut : 1. RNA virus diekstraksi dari setiap sampel. 2. RNA virus di “reverse-transcriptase” menjadi cDNA. 3. cDNA diamplifikasi dengan PCR. 4. Hasil amplifikasi dianalisa dengan elektroforesa agar untuk menentukan subtipe virus influenza. c. Kultur, isolasi, dan identifikasi virus sampel yang bebas H5N1 lewat penyaringan dengan metoda RT-PCR, selanjutnya akan dikultur dan jika positif virus influenza akan di-isolasi serta di-identifikasi galurnya. Langkah- langkah kultur, isolasi, identifikasi virus influenza adalah sbb: Universitas Sumatera Utara 1. Sel Madin Darby Canine Kidney MDCK disuspensi dengan Minimum Essential Medium selama 2 hari untuk mendapatkan konfluensi monolayer dimana virus influenza akan hidup. 2. Sampel dari hidung atau tenggorok sebanyak 0.2 ml diinokulasikan pada 1. 3. Kultur yang positif diinkubasi dengan antibodi monoklonal influenza A dan B untuk mengidentifikasi influenza A dan B. 4. Selanjutnya dilakukan test HI untuk mengidentifikasi galur virus influenza menggunakan antisera standar sesuai referensi.

2.15 Kerangka Konsepsional