3.3.4 Penentuan Kurva Standar IAA
IAA murni ditimbang sebanyak 0,001 g dan dilarutkan di dalam 100 ml akuades. IAA murni masing-masing dibagi kedalam tabung yang berbeda dengan
konsentrasi 0 ppm, 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm, dan 10 ppm. Dari setiap tabung reaksi diambil 3 ml kemudian ditambahkan 1 ml reagen Salkowski dan
dihomogenkan. Absorbansinya diukur dengan spektrofotometer UV-Visible dengan panjang gelombang 535 nm Aryantha et al., 2004.
3.3.5 Isolasi dan Pemurnian Bakteri Penghasil IAA
Sampel tanah sebanyak 1 g dimasukkan ke dalam 9 ml akuades steril secara aseptis, kemudian dibuat seri pengenceran 10
-4
. Setelah itu diambil 0,1 ml suspensi dan diinokulasi pada media Luria Bertani LB + L-triptofan dengan komposisi:
ekstrak ragi 5 g, Bacto Tryptone 10 g, Bacto agar 20 g, NaCl 5 g, L-tryptophan 5 mM, pH 7,5 Bric et al., 1991 dan dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali dan diamati
koloni yang muncul. Diinkubasi pada suhu 28 C selama 2 hari dan diamati koloni
yang muncul. Biakan murni diperoleh dengan menginokulasikan setiap koloni yang berdeba ke dalam petri yang berisi media LB+L-triptofan. Isolat tersebut
dikarakterisasi yang meliput i morfologi koloni, bentuk sel, morfologi sel, pewarnaan Gram dan uji biokimia yang terdiri atas uji sitrat, gelatin, katalase, motilitas, hidrolisa
pati, dan sulfida.
3.3.6 Uji Kemampuan Bakteri dalam Menghasilkan IAA Selama Masa Pertumbuhan Secara
In-vitro
Isolat murni disubkulturkan ke media LB + L-triptofan dan diinkubasi selama 48 jam. Isolat muda tersebut dibuat suspensi sebanyak 10 ml dengan standart Mac Farland
sehingga diperoleh suspensi bakteri dengan kerapatan sel 10
8
CFUml. Suspensi biakan bakteri diambil sebanyak 3 ml dan dimasukkan ke dalam 27 ml media LB cair
+ L-triptofan. Masing-masing perlakuan dilakukan 2 kali ulangan dan diinkubasi pada suhu 28
C dan digoyang dengan kecepatan 100 rpm selama 6 hari didalam shaker.
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
Setiap 2 hari sekali cairan kultur yang telah di shaker diambil sebanyak 0,1 ml untuk menghitung jumlah koloni dengan metode SPC Standart Plate Count. Diambil 3 ml
untuk menghitung kadar IAA yang dihasilkan oleh bakteri dan cairan kultur tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 5500 rpm selama 10 menit. Supernatan yang
diperoleh kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi steril dan diuji kemampuannya dalam menghasilkan IAA dengan metode kolorimetri yang
menambahkan reagen Salkowski 150 ml H
2
SO
4
pekat, 250 ml akuades, 7,5 ml FeCl
3.
6H
2
O 0,5 M Patten dan Glick, 2002, dengan perbandingan 4:1 supernatan : Salkowski Zahir et al., 1997. Campuran tersebut diinkubasi selama 20 menit dan
absorbannya diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 535 nm.
Konsentrasi IAA dari setiap isolat dapat diketahui dengan cara memasukkan nilai absorban supernatan ke persamaan garis kurva standart IAA yang telah
diperoleh. Persamaan garis regresi kurva standar IAA ditentukan dengan metode Least
Square Glover Mitchell, 2002 dalam Warsito, 2009 dengan rumus:
Y= a + bX a = Y – bX
� =
�∑�� −∑�∑� �∑�
2
−∑�
2
Dimana: a = intersep b = slope koefisien regresi
Y = absorbansi X = Konsentrasi
3.3.7 Uji Sinergisme
Kategori