3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini dirancang dengan menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap RAL. Perlakuan yang dibuat sesuai dengan jenis inokulan yang berhasil
diisolasi dan telah diuji kemampuan menambat nitrogen dan menghasilkan IAA dari laboratorium. Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan uji ANOVA.
Perlakuan terdiri atas: 1.
perlakuan tanpa penambahan bakteri dengan tanah kuning KT, 2.
perlakuan tanpa penambahan bakteri dengan tanah hitam KH, 3.
penambahan bakteri penambat nitrogen dengan tanah kuning N, 4.
penambahan bakteri penghasil IAA dengan tanah kuning I, 5.
penambahan bakteri penambat nitrogen + bakteri penghasil IAA dengan tanah kuning NI.
Setiap perlakuan dibuat ulangan sebanyak 5 kali dengan total keseluruhan adalah 25 percobaan.
3.3.1 Pengambilan Sampel
Sampel tanah diambil dari daerah rizosfer dan dimasukkan ke dalam kantong- kantong plastik yang diberi label yang menyatakan nomor kode lokasi
pengambilannya.
3.3.2 Isolasi dan Pemurnian Bakteri Penambat Nitrogen
Isolasi bakteri penambat nitrogen dengan menggunakan medium pertumbuhan JNFB James Nitrogen Free Malat Bromthymol Blue. Sebelumnya dilakukan
pengenceran tanah secara serial dan ditumbuhkan dengan metode cawan sebar pada medium pertumbuhan JNFB dengan komposisi media yaitu 5,0 g asam malat, 0,6 g
K
2
HPO
4
, 1,8 g KH
2
PO
4
, 0,2 g MgSO
4
.7H
2
O, 0,1 g NaCl, 0,2 g CaCl
2
.2H
2
O, 0,066 g FeEDTA, 0,02 g ekstrak khamir, 4,5 g KOH, 2 ml BTB, 2 ml mikronutrien, dan pH
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
5,8. Bakteri diinkubasi selama 48 jam, dan diamati koloni yang tumbuh. Biakan murni diperoleh dengan menginokulasikan setiap koloni yang berdeba ke dalam petri yang
berisi media JNFB. Isolat tersebut dikarakterisasi yang meliputi morfologi koloni, bentuk sel, morfologi sel, pewarnaan Gram dan uji biokimia yang terdiri atas uji sitrat,
gelatin, katalase, motilitas, hidrolisa pati, dan sulfida.
3.3.3 Uji Kemampuan Bakteri dalam Menambat Nitrogen
Isolat yang telah dimurnikan dan telah diuji biokimia diinokulasikan pada media JNFB semi padat di dalam tabung-tabung reaksi. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang
selama 10 hari. Jika pada medium semi padat tersebut telah terbentuk pelikel berwarna putih di bawah permukaan media maka selanjutnya dipindahkan ke dalam
cawan petri berisi medium JNFB padat. Isolat yang pelikelnya paling banyak dihasilkan, maka diuji lanjutan dengan metode Asai Reduksi Asetilen ARA
Susilowati et al, 2007.
Sebagai uji kuantitatif bakteri terhadap kemampuannya menambat nitogen dilakukan dengan metode ARA Rusmana Hadijaya, 1994. Isolat-isolat bakteri
ditumbuhkan pada medium JNFB cair pada suhu ruang selama satu hari. Selanjutnya kultur tersebut diinokulasikan kemedium JNFB semi padat dan diinkubasi selama 10
hari pada suhu ruang. Analisis ARA dilakukan setelah terbentuk suatu bentukan pelikel berwarna putih pada inkubasi 10 hari. Analisis ini diawali dengan melakukan
penggantian tutup kapas. Selanjutnya diambil 10 udara yang tersisa pada tabung dengan menggunakan jarum suntik dan diganti dengan gas asetilen, diikuti dengan
perlakuan inkubasi selama satu jam. Etilen yang terbentuk dideteksi dan diukur dengan menggunakan gas kromatografi GC Susilowati et al, 2007. Uji ARA ini
dilakukan di Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Bogor.
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
3.3.4 Penentuan Kurva Standar IAA
Kategori