Cara Kerja .1 Pembuatan Sampel Penelitian

m. Sabouraud’s Dextrose Broth SDB n. Phosphate Buffer Saline PBS o. Spiritus p. Alkohol 70 q. Saliva buatan r. Aluminium foil dan cling wrap Total, Indonesia s. Sarung tangan Everglove, Malaysia t. Masker Sensi Mask, Indonesia u. Kapas Bio Panca, Indonesia v. Serbet 3.6 Cara Kerja 3.6.1 Pembuatan Sampel Penelitian

3.6.1.1 Penanaman Model Induk dalam Kuvet dan Pembuatan Mold

1. Seluruh bagian dalam kuvet bawah diolesi dengan vaselin, kemudian membuat adonan gips dengan perbandingan untuk satu kuvet bawah 250 gram gips : 150 ml air. Adonan diaduk dengan spatula selama 15 detik kemudian dilanjutkan dengan vacum mixer sampai tercampur homogen selama 30 detik dan adonan dimasukkan ke dalam kuvet bawah yang telah diletakkan di atas vibrator. 2. Model induk diolesi dengan vaselin, kemudian dibenamkan pada adonan gips di dalam kuvet bawah sampai permukaan model induk sama rata dengan gips, satu kuvet berisi 8 buah model induk. Setelah adonan gips agak mengeras, rapikan gips yang berlebihan dan diamkan sampai gips mengeras selama 60 menit. 3. Permukaan gips pada kuvet bawah diolesi dengan vaselin dan disatukan dengan kuvet atas lalu diisi adonan gips dengan perbandingan 200 gram gips : 100 ml air dan di atas vibrator. Setelah gips mengeras, kuvet dibuka, model induk diangkat, kemudian mold yang didapat disiram dengan air panas sampai bersih untuk membuang vaselin yang tersisa dan dibiarkan hingga kering. 4. Setelah kering, mold diolesi dengan bahan separator cold mould seal kemudian tunggu selama 20 menit sesuai dengan petunjuk pabrik. Universitas Sumatera Utara

3.6.1.2 Pengisian Resin Akrilik pada Mold

1. Polimer dan monomer dituangkan ke dalam pot porselen dengan perbandingan 2 gram polimer : 1 ml monomer sampai semua monomer terserap oleh polimer sesuai petunjuk pabrik. 2. Adonan diaduk dengan spatula semen sampai monomer dan polimer tercampur baik dan homogen. 3. Adonan didiamkan kira-kira selama waktu yang dianjurkan pabrik, sampai mencapai tingkat dough stage dan tidak menempel pada dinding pot porselen. 4. Permukaan mold diolesi dengan bahan cold mould seal kemudian diisi dengan adonan resin akrilik. 5. Letakkan plastik selopan diantara kuvet atas dan bawah, lalu ditutup dan dipres dengan tekanan 1000 psi 70 kgcm 2 menggunakan pres hidrolik. 6. Kuvet atas dibuka, plastik selopan dilepas dan akrilik yang berlebihan dipotong menggunakan lecron mass. 7. Kuvet atas ditutup kembali lalu dilakukan pres akhir secara perlahan- lahan sampai tekanan 2200 psi 154 kgcm 2 dan dibiarkan pada suhu ruangan selama 30 menit. 8. Kemudian baut kuvet dipasang untuk mempertahankan kuvet atas dan bawah tetap rapat dan dibiarkan pada selama 15 menit.

3.6.1.3 Proses Kuring

1. Air diisikan ke dalam waterbath yang akan digunakan untuk proses kuring kemudian kuvet dimasukkan ke dalam waterbath. 2. Suhu dan waktu kuring diatur, pada tahap pertama dipertahankan 70 o C selama 90 menit. sesuai Japan industrial Standard 3. Kemudian pada tahap kedua suhu kuring dinaikan menjadi 100 C dan dipertahankan selama 30 menit. sesuai Japan industrial Standard 4. Setelah itu kuvet dikeluarkan dari waterbath dan dibiarkan sampai mencapai suhu ruangan. Universitas Sumatera Utara

3.6.1.4 Penyelesaian Akhir Sampel

Sampel dikeluarkan dari kuvet, akrilik yang berlebih dibuang dan dirapikan untuk menghilangkan bagian yang tajam dengan menggunakan bur frasser serta dilanjutkan menghaluskan seluruh permukaan sampel RAPP dengan menggunakan kertas abrasif nomor 500 dan 800. 3.6.2 Pembuatan Media Pertumbuhan Candida albicans 3.6.2.1 Pembuatan Sabouraud’s Dextrose Agar SDA 1. Bahan pembuatan media SDA yang diperlukan untuk 1 liter air adalah 65 gram, sehingga untuk 460 ml air diperlukan 30 gram bahan media SDA sesuai kebutuhan dan ditimbang dengan menggunakan timbangan digital dan analitik. 2. Masukkan bahan media SDA pada labu erlenmeyer, kemudian ditambahkan 500 ml akuades sebagai pelarut dan panaskan bahan di atas hotplate magnetik stirer sehingga semua bahan terlarut sempurna yang ditandai dengan larutan akan mendidih dan terlihat lebih bening kekuningan Gambar 10. Gambar 10. Pembuatan SDA 3. Tutup rapat labu erlenmeyer dengan menggunakan kapas, kemudian melapisinya dengan aluminium foil dan cling wrap. 4. Selanjutnya, sterilkan media SDA dengan autoklaf pada tekanan 2 atm hingga mencapai suhu 121 C selama 1 jam. 5. Memanaskan media SDA kembali, lalu menuangkannya pada cawan petri secara aseptik hingga merata. Universitas Sumatera Utara

3.6.2.2 Pembuatan Sabouraud’s Dextrose Broth SDB

1. Bahan pembuatan media SDB yang diperlukan untuk 1 liter air adalah 20 gram dekstrosa ditambah 10 gram pepton, sehingga untuk 300 ml air diperlukan 3 gram pepton ditambah glukosa 6 gram sesuai kebutuhan dan ditimbang dengan menggunakan timbangan digital dan analitik. 2. Masukkan bahan media SDB pada labu erlenmeyer, kemudian larutkan 250 ml akuades tanpa perlu dipanaskan. Aduk dengan spatula sampai semua bahan terlarut sempurna hingga terlihat bening kekuningan. 3. Tutup rapat labu erlenmeyer dengan menggunakan kapas, kemudian melapisinya dengan aluminium foil dan cling wrap. Selanjutnya, sterilkan media dengan autoklaf pada tekanan 2 atm hingga mencapai suhu 121 C selama 1 jam. 4. Memanaskan media kembali, lalu menuangkannya pada tabung reaksi secara aseptik masing-masing 10 ml hingga merata.

3.6.3 Pembuatan Phosphate Buffer Saline PBS

1. Phosphate Buffer Saline PBS dapat dibuat dari NaCl sebanyak 3,2 gram, KCl sebanyak 0,08 gram, KH 2 PO 4 sebanyak 0,96 gram dan Na 2 HPO 4 sebanyak 1,58 gram yang ditimbang dengan menggunakan timbangan digital dan analitik. 2. Bahan-bahan tersebut dilarutkan dalam 400 ml akuades dan dihomogenkan dengan menggunakan magnetik stirer di dalam labu erlenmeyer. Atur pH larutan menggunakan pH meter dengan menambahkan larutan HCl 1 N hingga mencapai pH 7,4. Kemudian pindahkan larutan Phosphate Buffer Saline PBS tersebut ke dalam gelas beaker 500 ml dan tambahkan kembali akuades sampai tanda batas. 34

3.6.4 Pembuatan Suspensi Candida albicans

Pembuatan suspensi Candida albicans dilakukan dengan mengambil 1-2 ose biakan murni Candida albicans yang telah dikultur, kemudian dicampurkan dengan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar Mac Farland 1x10 8 CFUml. Universitas Sumatera Utara 3.6.5 Perendaman Sampel 3.6.5.1 Perendaman Sampel dalam Akuades dan Saliva Buatan Sampel RAPP dicuci dengan air mengalir lalu disimpan di dalam botol selai kaca dan direndam dalam akuades pada suhu 37 C selama 48 jam sebelum diberikan perlakuan agar sampel menjadi jenuh. 27,28 Kemudian sampel disterilisasi di dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 1 jam. Selanjutnya, sampel dimasukkan ke dalam gelas beaker yang berisi saliva buatan dan direndam selama 1 jam, lalu dibilas dengan Phosphate Buffer Saline PBS sebanyak dua kali. 19,41

3.6.5.2 Perendaman Sampel dalam Suspensi Candida albicans

Sampel RAPP dikontaminasi dengan cara dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer yang berisi suspensi Candida albicans, kemudian diinkubasi awal pada suhu 37 C selama 24 jam. 3.6.5.3 Perendaman Sampel dalam Vinegar Apel 5, Vinegar Apel 6,23, Sodium Hipoklorit 1, dan NaCl 0,9 Setelah 24 jam diinkubasi, selanjutnya tiap satu sampel RAPP dimasukkan dan direndam selama 8 jam di dalam satu tabung reaksi pada masing-masing kelompok sebanyak 2 ml per sampel Gambar 11. Pada penelitian ini sampel dibagi menjadi 4 kelompok: a. Kelompok sampel yang akan direndam dalam vinegar apel konsentrasi 5 selama 8 jam kelompok A. b. Kelompok sampel yang akan direndam dalam vinegar apel konsentrasi 6,23 selama 8 jam kelompok B. c. Kelompok sampel yang akan direndam dalam sodium hipoklorit 1 selama 8 jam kelompok C. d. Kelompok sampel yang akan direndam dalam NaCl 0,9 selama 8 jam kelompok D. Universitas Sumatera Utara A B C D Gambar 11. Kelompok sampel A. Perendaman dalam vinegar apel 5, B. Perendaman dalam vinegar apel 6,23, C. Perendaman dalam sodium hipoklorit 1, D. Perendaman dalam NaCl 0,9. Setelah 8 jam perendaman maka sampel RAPP dapat dikeluarkan dari tabung reaksi, dibilas kembali dengan Phosphate Buffer Saline PBS sebanyak dua kali, dan dibiarkan sampai kering, lalu dilakukan penentuan jumlah Candida albicans.

3.6.6 Penentuan Jumlah Candida albicans

1. Sterilkan terlebih dahulu meja kerja, tangan peneliti dan udara di daerah sekitar kerja dengan menggunakan alkohol 70 dan sterilkan pinset dengan menggunakan bunsen, lalu diamkan sampai dingin. 2. Sampel RAPP dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml Sabouraud’s Dextrose Broth SDB, kemudian digetarkan dengan alat getar vortex selama 30 detik untuk melepaskan Candida albicans yang melekat pada lempeng uji Gambar 12. Gambar 12. Tabung reaksi SDB digetarkan alat vortex 5. Selanjutnya ambil sekitar 0,1 ml cairan dari dalam tabung reaksi yang berisi Sabouraud’s Dextrose Broth SDB dengan menggunakan mikropipet, lalu dibenihkan pada Sabouraud’s Dextrose Agar SDA dengan cara meneteskan dan menyebarkan cairan tersebut secara merata ke seluruh permukaan dengan menggunakan hockey. Universitas Sumatera Utara 6. Pada saat pembenihan suspensi Candida albicans yaitu ketika membuka tutup tabung reaksi atau cawan petri harus dilakukan dekat dengan bunsen sehingga mencegah mikroorganisme lain yang tidak diperlukan masuk ke dalam cawan petri. 7. Tepi cawan petri dipanaskan dengan gerakan melingkar di atas bunsen. Setelah itu, cawan petri dilapisi dengan cling wrap dan lakukan inkubasi akhir pada suhu 37 C selama 48 jam. 8. Penghitungan jumlah Candida albicans dilakukan setelah 48 jam dengan menggunakan colony counter dalam satuan CFUml. Universitas Sumatera Utara

3.7 Kerangka Operasional Penelitian