Ekstraksi B. rotundiformis, N. oculata dan Prochloron sp.

3.3.1.5 Miksis

Informasi terjadinya miksis pada B. rotundiformis dibutuhkan untuk mengetahui keadaan stres yang diduga memacu produksi senyawa bioaktif. Untuk itu digunakan B. rotundiformis dari telur generasi pertama TGP. Telur generasi pertama TGP dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak tiga butir telur per tabung yang telah diisi alga mikro yang berbeda N. oculata dan Prochloron sp.. Setiap perlakuan pakan dilakukan tiga kali ulangan, tiap ulangan menggunakan enam tabung reaksi, jadi ada 36 tabung untuk perlakuan dua jenis pakan alga N. oculata dan Prochloron sp. Pengamatan dilakukan setiap hari dan dihitung jumlah B. rotundiformis yang dihasilkan. Perhitungan dilaksanakan di bawah stereomikroskop dengan perbesaran 40 kali. Aspek-aspek yang diamati adalah Betina amiktik ♀♀, Betina miktik ♂♀, Betina tanpa telur ♀? dan Betina yang membawa telur dorman ♀D. Betina amiktik ♀♀ adalah betina yang melakukan reproduksi partenogenesis, telurnya oval dan berwarna agak gelap. Betina miktik ♂♀ adalah betina yang membawa telur bulat berwarna abu- abu dan ukurannya kira-kira setengah telur amiktik dan nantinya menetas jadi jantan. Betina tanpa telur ♀? adalah betina yang belum membawa telur, karena itu belum dapat diidentifikasi miktik atau amiktik. Betina yang membawa telur dorman ♀D adalah telurnya oval, berukuran sama dengan telur amiktik, berwarna coklat atau oranye dan terdapat rongga udara pada sisi telur.

3.3.2 Kajian Bioaktif

3.3.2.1 Ekstraksi B. rotundiformis, N. oculata dan Prochloron sp.

Untuk kebutuhan ekstraksi, B. rotundiformis dikultur dalam wadah 1000 ml. Pada tahap awal B. rotundiformis dikultur pada suhu dan salinitas optimum yakni suhu 28 ºC dan salinitas 20 ppt James dan Abu 1990. Kemudian sebagian B . rotundiformis diadaptasikan pada salinitas 4 ppt, 40 ppt, 50 ppt dan 60 ppt. Untuk memperoleh salinitas yang rendah yaitu diencerkan dengan aquades, kemudian diukur dengan bantuan refraktometer sampai dicapai salinitas yang diinginkan. Sedangkan untuk memperoleh salinitas yang lebih tinggi, air laut dididihkan sekitar dua jam dan didinginkan, setelah itu diukur dengan refraktometer sampai diperoleh salinitas yang diinginkan. Adaptasi B . rotundiformis pada salinitas yang berbeda dilakukan dengan cara menurunkan dan menaikkan salinitas medium sebesar 2 ppt setiap dua hari dalam tabung reaksi 10 ml yang berisi 10 individu. Setelah diadaptasikan, B. rotundiformis dipindahkan kedalam wadah 1000 ml dengan kepadatan 50 individu dan dikultur pada salinitas 4 ppt, 20 ppt, 40 ppt, 50 ppt, 60 ppt dengan dua jenis pakan berbeda N. oculata dan Prochloron sp.. Panen B. rotundiformis dilakukan dengan menggunakan jaring plankton 40 μm dan dikerjakan dalam wadah berisi es. B . rotundiformis yang tersaring dipindahkan ke dalam tabung Ependorf dengan menggunakan pipet. Hasil saringannya disimpan dalam Ependorf yang sudah diberi label, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disimpan dalam freezer pada suhu -20 ºC Gambar 8. Gambar 8 Kultur dan pemanenan B. rotundiformis untuk ekstraksi senyawa bioaktif Disaring dimasukkan dalam ependorf - Diberi label - Dibungkus dengan alumuniubm foil - Diberi label kembali Di simpan di freezer -20 C 10 ml C A B 1 Individu l Dari alam 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 4 ppt 20 ppt 40 ppt 50 ppt 60 ppt D E 4 ppt 20 ppt 40 ppt 50 ppt 4 ppt 40 ppt 50 ppt 60 ppt 20 ppt 1000 1000 ml 1000 ml 1000 ml 1000 ml 1000 ml adaptasi Untuk mendeteksi kandungan senyawa bioaktif maka dilakukan proses ekstraksi terhadap B. rotundiformis dan alga mikro N. oculata dan Prochloron sp. Tujuan pengujian alga mikro adalah untuk memastikan apakah alga mikro sebagai pakan B. rotundiformis juga memberikan kontribusi terhadap kandungan senyawa bioaktif yang dimiliki oleh B. rotundiformis. Untuk mendapatkan ekstrak kasar, sampel B. rotundiformis, N. oculata dan Prochloron sp. digerus dengan alat penggerus lumpang dan dihomogenasikan dengan metanol 80 perbandingan 1:2 satu bagian sampel plankton dan 2 bagian metanol. Homogenat yang ada direndam selama 24 jam, setelah itu disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit, sehingga diperoleh presipitat 1 dan supernatan 1. Dalam presipitat 1 ditambahkan lagi metanol 1:2 kemudian diinkubasi selama 8 jam, setelah itu disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm sehingga diperoleh presipitat 2 dan supernatan 2. Selanjutnya supernatan 1 dan 2 dengan presipitat 1 dan 2 yang diperoleh, dievaporasi dengan menggunakan rotari vacum evaporator sehingga diperoleh ekstrak kasar rotifera B. rotundiformis, N. oculata dan Prochloron sp. Harborne 1987; Houghton 1998 Gambar 9. Gambar 9 Prosedur ekstraksi - Pengocokan - Sentrifus 3000 rpm, 15’ Pengocokan Homogenasi sampel + metanol 80 1:2 Sampel digerus dihancurkan Lumpang Shaker Presipitat 1 ditambahkan metanol 80 1:2 Ekstrak Kasar Presipitat 1,2 dan supernatan EVAPORASI Sentrifus 15 it Presipitat 1, supernatant 1 Presipitat 2, supernatant 2

3.3.2.2 Inokulum Bakteri