3.3.2.2 Inokulum Bakteri
dan Antibiotik Pembanding
Bakteri yang digunakan untuk menguji aktivitas antibakteri adalah bakteri gram positif dan gram negatif. Mikroba-mikroba tersebut digolongkan dalam
mikroba patogen atau penyebab penyakit, dan kedua golongan mikroba tersebut yang akan dicegah pertumbuhannya dengan antibakteri yang terdapat pada
B . rotundiformis. Bakteri uji tersebut adalah Vibrio cholerae gram negatif, bentuk
batang bengkokspiral, Bacillus subtilis gram positif, bentuk batang dan Escherichia coli
gram negatif, bentuk bulat, Ndukwe et al. 2005. Isolat bakteri dalam medium miring ditumbuhkan di cawan petri yang berisi medium agar steril
dengan cara digores menggunakan jarum öse. Setelah bakteri berumur 24 jam, masing-masing bakteri tersebut dimasukkan ke dalam tabung yang berisi larutan
NaCl larutan saline 0,9 sebanyak 10 ml dan diukur kepadatannya hingga 10
9
selml dengan menggunakan metode McFarland. Antibiotik pembanding yang digunakan adalah amoksisilin dan tetrasiklin. Dosis masing-masing antibiotik
adalah 0,5 mgml.
3.3.2.3 Pembuatan Medium Agar
Medium agar dibuat dari nutrien agar NA sebanyak 2 gram yang dilarutkan dalam 100 ml aquades lalu dipanaskan sambil diaduk, kemudian
disterilkan dengan otoklaf selama 15 menit pada suhu 121 ºC. Selanjutnya nutrien agar dituang dalam cawan petri steril secara merata masing-masing 15 ml dan
dibiarkan mengeras. Untuk memastikan medium agar ini bersih dan tidak terkontaminasi bakteri lain, maka medium agar dibiarkan selama 24 jam. Medium
agar yang tidak terkontaminasi dengan bakteri lain selanjutnya digunakan untuk kebutuhan uji aktivitas antibakteri Gambar 10.
Gambar 10 Pembuatan medium agar
3.3.2.4 Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pengujian antibakteri dilakukan untuk menentukan kesanggupan membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme hidup. Metode pengujian
antibakteri yang digunakan adalah metode agar kertas cakram paper disc method berdasarkan Jorgensen et al. 1999 dan Waksman 1974 dalam Wangidjaja 2002.
Pada cara difusi ini larutan senyawa antibakteri akan berdifusi dari kertas saring yang mengandung senyawa antibakteri lalu masuk kedalam medium agar yang
telah diinokulasi dengan mikroba penguji. Setelah inkubasi, terjadi hambatan dari pertumbuhan bakteri uji sehingga terjadi daerah bening yang terbentuk di sekitar
kertas cakram yang ditetesi suspensi senyawa antibakteri tersebut. Daerah hambatan yang terbentuk luasnya berbeda-beda sesuai dengan kadar senyawa
antibakteri yang dikandungnya. Otoklaf
Nutrien agar 2 gr
Dilarutkan
Ditimbang Aquades 100 ml
Dituang Nutrien agar
Pengujian antibakteri dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Hayati Laut Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Unsrat. Medium agar yang telah disiapkan
diolesi bakteri uji dengan menggunakan kapas steril. Setelah itu kertas cakram yang terbuat dari kertas saring Whatman steril berdiameter 6 mm diletakkan diatas
medium agar yang telah diolesi bakteri uji. Selanjutnya 1 mg ekstrak kasar B. rotundiformis
dilarutkan dalam 1 ml pelarut metanol 1 mgml, dan dari konsentrasi ekstrak kasar ini diambil 1 mikro liter dan diteteskan ke kertas cakram
yang telah disiapkan, juga diteteskan antibiotik pembanding dan metanol sebagai kontrol, kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah diinkubasi 24 jam, diukur
zona bening yang terbentuk yaitu berupa daerah bening sekeliling kertas cakram. Dalam pengujian ini bakteri yang digunakan adalah bakteri V. cholerae, B. subtilis
dan E. coli. Antibiotik yang dicoba sebagai pembanding adalah tetrasiklin dan amoksisilin.
Besarnya diameter zona hambat yang terbentuk dari masing-masing ekstrak kasar B. rotundiformis dibandingkan dengan yang dibentuk oleh antibiotik dan
metanol. Makin besar diameter zona bening atau zona hambat dari ekstrak berarti makin besar daya antibakterinya Gambar 11.
Gambar 11 Pengujian aktivitas antibakteri Inkubas
Ukur zona
bening
3.4 Analisis Data
3.4.1 Kelimpahan Rotifera dan Parameter Lingkungan
Untuk menghitung kelimpahan plankton, terlebih dahulu dihitung volume
air laut yang tersaring dengan mengikuti rumus Vs =
πr
2
d. Dimana : V = volume air yang tersaring l,
π = 3,14, r = radius mulut plankton net, d = panjang lintasan. Kelimpahan plankton dinyatakan secara kuantitatif dalam jumlah indm
3
. Kelimpahan plankton dihitung berdasarkan rumus : N = n x VrVo x 1Vs.
N = Jumlah sel per meter
3
, n = Jumlah individu yang teramati, Vr = Volume air yang tersaring dalam cod end, Vo = Volume air yang diamati, Vs = Volume air
yang tersaring. Perhitungan kelimpahan rotifera diawali dengan menghitung volume air
yang tersaring dengan menggunakan rumus APHA 1992 yaitu: V=
π r
2
d Dimana :
V = volume air yang tersaring π = 3,141592654
r = radius mulut plankton net 0,15 m
d = panjang lintasan 10 m Kelimpahan rotifera dinyatakan secara kuantitatif dalam jumlah indm
3
yang dihitung berdasarkan rumus : N = n x VsVo x 1Vt
Dimana : N = jumlah indmeter kubik
n = jumlah ind yang diamati Vt = Volume air tersaring 706,858 L
Vo = Volume air yang diamati 0,0010 L Vs = Volume air dalam cod end 0,0280 L
Untuk mengetahui perbedaan parameter lingkungan berdasarkan lokasi penelitian, musim, pasang surut serta pengaruh interaksi antara lokasi dan musim
maupun interaksi antara stasiun dengan musim maka dilakukan analisis ragam ANOVA desain faktorial pada masing-masing parameter.