Tempat dan Waktu penelitian Uji Indol Uji Uji Voges Proskauer

19 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu penelitian

Penelitian dilaksanakan di Pusat Laboratorium Terpadu Universitas Islam Negeri Jakarta Syarif Hidayatullah, Jakarta. Waktu penelitian dilakukan pada bulan Maret hingga Juni 2016. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Cawan petri, tabung reaksi, tabung durham, pipet, autoklaf ALP, jarum ose, kaca objek, mikroskop Olympus, bunsen, Laminar Air Flow, inkubatorMemmert, alumunium voil, neraca analitik Ohaus, rak tabung reaksi, micropipet Transferpette, pipet volum, vortex, bulp, dan hot plate Heidolph.

3.2.2 Bahan

Es batu kristal dan es balok dari wilayah kelurahan Cibubur, media NutrientAgar Oxoid, medium Lactose Broth Oxoid, medium MRVP Merck, medium EMBA Oxoid, medium Sulfide Indole Motility Merck, medium Simmons Citrate Agar Merck, kristal violet, lugol, alkohol 70, methyl red, iodine, safranin, barritt’s A atau alfa naftol 5, barritt’s B atau KOH 40, NaCl fisiologis, reagen kovac ’s, minyak imersi, aquades, aquabidest, dan spirtus.

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Teknik Pengambilan Sampel

Sampel es yang diambil berjumlah 7 sampel, dimana 6 sampel es kristal yang diambil dari restoran di daerah kelurahan Cibubur Jakarta Timur dan 1 sampel dari es balok yang dijual oleh distributor es balok depot es balok dan blanko yang digunakan adalah aquadest steril sebagai pembanding. Sampel es batu yang didapatkan, kemudian dikemas dalam kemasan plastik klip steril dan disimpan pada suhu 25-30 ᵒ C. Es batu yang akan dianalisa terlebih dahulu telah dicairkan dan disimpan pada suhu 25-30 ᵒ C. Sampel yang sudah diambil tidak lebih dari 24 jam dibawa ke laboratorium untuk diuji. 20 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.2 Preparasi Alat

Alat dari kaca, gelas dan medium untuk pertumbuhan mikroba yang akan digunakan dalam penelitian ini disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 ᵒ C tekanan 1 atm selama 15 menit. 3.3.3 Pembuatan Media Pertumbuhan 3.3.3.1 Nutrient Agar NA Miring Media Nutrient Agar NA dibuat dengan menimbang sebanyak 28 gram Nutrient Agar NA dan dilarutkan dalam 1 liter aquadest kemudian dihomogenisasi dengan magnetic stirrerdan dipanaskan dengan menggunakan hot plate. Medium kemudian diambil ±5 mL dan dimasukan pada tabung reaksi.Medium disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 ᵒ C selama 15 menit, setelah disterilisasi media dimiringkan 45 º dan dipadatkan.

3.3.3.2 Lactose broth LB

Cara membuat media Lactose broth LB dengan menimbang sebanyak 13 gram LB dan dilarutkan dalam 1 liter aquadest kemudian dihomogenisasi dengan magnetic stirrer dan dipanaskan dengan menggunakan hot plate. Sebanyak 10 ml media dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi tabung durham dan disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 º C selama 15 menit. 3.3.3.3 Eosin Methylene Blue Agar EMBA Medua Eosin Methylene Blue Agar EMBA dibuat dengan menimbang sebanyak 37,5 gram EMBA dan dilarutkan dalam 1 liter aquadest kemudian dihomogenisasi dengan magnetic stirrer dan dipanaskan dengan menggunakan hot plate. Medium disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 º C selama 15 menit. 21 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.3.4 Sulfide Indole Motility SIM

Media Sulfide Indole Motility SIM dibuat dengan menimbang sebanyak 30 gram SIM dan dilarutkan dalam 1 liter aquadest kemudian dihomogenisasi dengan magnetic stirrer dan dipanaskan dengan menggunakan hot plate. Medium kemudian diambil ±5 mL dan dimasukan pada tabung reaksi. Medium disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 º C selama 15 menit.

3.3.3.5 Methyl Red-Voges Proskauer MRVP

Media Methyl Red-Voges Proskauer MRVP dibuat dengan cara menimbang sebanyak 17 gram MRVP dan dilarutkan dalam 1 liter aquadest kemudian dihomogenisasi dengan magnetic stirrer dan dipanaskan dengan menggunakan hot plate. Medium kemudian diambil ±5 mL dan dimasukan pada tabung reaksi. Medium disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 º C selama 15 menit.

3.3.3.6 Simmons Citrate Agar

Media Simmons Citrate Agar dibuat dengan minimbang sebanyak 23 Gram Simmons Citrate Agardan dilarutkan dalam 1 liter aquadest kemudian dihomogenisasi dengan magnetic stirrer dan dipanaskan dengan menggunakan hot plate. Medium kemudian diambil ±7mL dan dimasukan pada tabung reaksi. Medium disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 º C selama 15 menit, setelah disterilisasi media dimiringkan 45 º dan dipadatkan.

3.3.4 Uji Coliform

3.3.4.1 Uji Penduga Presumtive test

Uji penduga presumtive test dengan menggunakan 9 tabung seri 3-3-3. Masin-masing tabung diisikan media lactose brothsebanyak 10 ml dan dilengkapi dengan tabung durham dalam posisi terbalik. Sampel es batu yang telah mencair diambil sebanyak 10 ml, 1 ml, 0,1 ml. 3 seri tabung pertama diisikan 10 ml sampel es batu dengan menggunakan pipet volum, 3 seri tabung kedua diisikan 1 ml sampel es batu, dan 3 seri sampel tabung ketiga diisikan 0,1 ml sampel es batu dengan menggunakan mikropipet. Pengisian dilakukan secara aseptis. Semua 22 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta tabung reaksi kemudian diinkubasi pada inkubator pada suhu 37 ᵒ C dan diamati hasilnya. Hasil positif jika terbentuk gas berupa rongga kosong pada tabung durham Bambang dkk., 2014; Hadi dkk., 2014.

3.3.4.2 Uji Penguat Confirmative test

Tabung yang positif pada presumptive test uji penduga dilanjutkan dengan uji penguat. Diambil 1-2 ose dan digoreskan pada cawan yang berisi medium EMBA dan diinkubasi pada inkubator pada suhu 37 ᵒ C dan ditunggu 1 x 24 jam. Bakteri yang diduga Escherichia coli memiliki koloni berwarna hijau metalik Widiyanti dkk., 2004 . 3.3.4.3Uji Pelengkap Completed Test Tabung yang positif pada uji penguat diambil 1 ose dan diinokulasikan ke dalam lactose broth dengan jarum inokulasi secara aseptik dan diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 1 x 24 jam. Hasil positif terbentuknya gelembung pada tabung durham dan pengujian untuk membedakan bakteri golongan coli dari bakteri golongan coli fekal dengan cara medium NA miring diinkubasikan pada suhu 37 ᵒ C untuk golongan coli dan diinkubasi pada suhu 42 ᵒ C untuk golongan coli fekal dan hasil bakteri yang tumbuh di NA dilakukan uji pewarnaanWidiyanti dkk., 2004 . 3.3.5 Identifikasi Bakteri Escherichia coli 3.3.5.1 Pewarnaan Gram Bakteri yang telah diinokulasi pada media Nutrient Agar NA miring dan sudah diinkubasikan selama 1 X 24 jam pada suhu 36-37 ᵒ C, kemudian diambil ±1 ose dan diletakan pada gelas objek. Gelas objek difiksasi dengan dilewatkan apusan di atas api bunsen. Apusan ditetesi larutan kristal violet dibiarkan selama 1 menit kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Apusan ditetesi beberapa tetes iodine, dibiarkan selama 1 menit setelah itu dicuci kembali menggunakan air mengalir dan dikering anginkan. Apusan ditetesi alkohol dibiarkan 30 detik kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan, kemudian apusan diberi beberapa tetes safranin lalu dibiarkan selama 30 detik dan 23 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dicuci menggunakan air mengalir setelah itu dikering anginkan dan diamati dibawah mikroskop Apriani dkk., 2014.

3.3.5.2 Uji IMViC Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Simmons Citrate

a. Uji Indol

Bakteri uji yang telah ditumbuhkan pada Nutrient Agar NA miring diambil sebanyak satu ose dan diinokulasikan kedalam media Sulfide IndoleMotility SIMdengan kontrol satu tabung tidak diinokulasikan bakteri. Diinkubasi pada suhu 37 ᵒ Cselama 24 jam, kemudian ditambahkan 5 tetes reagen kovac ’s kedalam masing-masing tabung dan didiamkan selama 10 menit. Reaksi indol positif ditandai dengan terbentuknya lapisan merah pada permukaan biakan Hadioetomo, 1993; Hemraj dkk., 2013. Uji indol untuk melihat kemampuan organisme yang mendegradasi asam amino triptofan dan menghasilkan indol Hemraj dkk., 2013.

b. Uji

Methyl Red Bakteri uji yang telah ditumbuhkan pada Nutrient Agar NA miring diambil sebanyak satu ose dan diinokulasikan ke dalam media MR-VP dengan blanko satu tabung berisi media MR-VP yang tidak diinokulasikan bakteri dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ᵒ C. Ditambahkan 3 tetes pereaksi methyl red. Uji positif ditandai dengan perubahan warna medium menjadi merah, artinya terbentuk asam Hadioetomo, 1993. Menurut Sudarsono 2008, uji merah metil methyl red test untuk mengetahui kemampuan bakteri mengoksidasi glukosa dengan memproduksi asam dengan konsentrasi tinggi sebagai hasil akhirnya.

c. Uji Voges Proskauer

Bakteri uji yang telah ditumbuhkan pada Nutrient Agar NA miring diambil sebanyak satu ose dan diinokulasikan ke dalam media MR-VP yang tidak diinokulasikan bakteri. Diinkubasikan pada suhu 37 ᵒ C selama 48 jam ditambahkan 0,6 ml alfa naftol 5 dan 0,2 ml KOH 40 kemudian di vorteks dan didiamkan. Uji VP positif ditandai dengan terbentuknya cincin warna merah muda 24 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta SNI, 1992. Uji Voges Proskauer adalah uji untuk mendeteksi asetoin dalam kultur bakteri Hemraj dkk., 2013.