40
0,22 ìm secara aseptik dan hasil penyaringan dimasukkan dalam botol steril dan disimpan dalam lemari es pada suhu 2 – 8
o
C sampai digunakan kembali. Apabila akan digunakan sebagai media tumbuh media DMEMF12 ditambahkan 10
FBS Fetal Bovine Serum Rusmarilin 2003. Suspensi sel 1 x 10
5
selml dimasukkan ke dalam sumur-sumur microplate sebanyak 180 ì l tiap sumur. Hidrolisat yang mengandung senyawa-senyawa
kitooligomer dengan konsentrasi sebesar 170 µgml ditambahkan dalam sumur sebanyak 20 ìl. Penggunaan kontrol positif anti kanker senyawa 2-Bromo 2-
deoksi uridin dengan konsentrasi 170 µgml sebanyak 20 ìl. Jumlah total volume dalam tiap sumur sebanyak 200 ìl. Kultur diinkubasi pada inkubator dengan
kondisi 5 CO
2
, 37
o
C, dan RH 90 selama 4 empat hari. Setelah masa inkubasi berakhir dilakukan pengujian dengan metode MTT,
seperti pada pengujian MTT dengan sel limfosit
7. Pengolahan Data
Data absorbansi perlakuan masing-masing menggunakan ulangan sebanyak 3 kali, dihitung dan dikonversi ke rumus :
- Untuk aktivitas proliferasi sel limfosit : Proliferasi = Absorbansi sampel Abs Kontrol x 100
- Untuk penghambatan proliferasi sel kanker : 1- Absorbansi sampelabsorbansi kontrol x 100
absorbansi kontrol adalah absorbasi pengujian yang hanya berisi suspensi sel dan media Damayanti 2002.
8. Pengujian Mekanisme Antiproliferasi Sel Kanker oleh Senyawa-senyawa Kitooligomer
a. Pengujian Apoptosis dengan Metode Hoechts Staining
Pengujian perubahan inti sel akibat apoptosis dilakukan dengan prinsip terikatnya DNA sel dengan fluorochrome -bis-benzimide trihydrochloride Hoechst
33342. Setelah dilakukan pemberian bahan uji selama semalam pada kultur sel, pelet sel yang diperoleh dari hasil sentrifugasi selama 10 menit pada 228 x g,
kemudian difiksasi pada temperatur 37
o
C selama 30 menit dengan larutan formalin 3.7 dalam PBS. Pelet sel kemudian dicuci dengan PBS dan diwarnai
dengan Hoechst dye 24 ìgml selama semalam pada 4
o
C. 20 ìl suspensi sel tersebut ditempatkan pada cover glass kemudian diamati dan difoto
41
menggunakan mikroskop fluorosens untuk melihat degradasi kromatin dari sel yang mengalami apoptosis Wispriono et al; 2002.
b. Pengujian Kebocoran Membran
Kultur sel sebanyak 2 ml dengan konsentrasi sel 1 x 10
6
selml dalam wadah cawan petri steril berdiameter 2 cm, diinkubasi pada inkubator CO
2
selama 24 jam dengan bahan uji hidrolisat yang mengandung senyawa-senyawa kitooligomer dengan konsentrasi 17 µgml kultur. Setelah masa inkubasi selesai,
sel disentrifugasi pada 228 x g selama 5 lima menit, supernatan dibuang dan ditambahkan PBS phosphate buffer saline, sentrifus d ilakukan lagi pada kondisi
yang sama, pelet yang diperoleh dipreparasi dengan fiksasi menggunakan glutaraldehid selama 1.5 jam, pencucian dengan asam tanik dan PBS masing-
masing selama 20 menit. Dilanjutkan dengan fiksasi dengan osmium selama dua jam, pencucian dengan akuabides selama 10 menit, dehidrasi alkohol bertingkat
selama 10 menit, dan terakhir pencucian dengan t-butanol selama 10 menit. Suspensi sel kemudian diteteskan pada membran steril. Terakhir dilakukan
coating pada membran tersebut dengan logam emas sebelum dianalisis dengan
alat SEM. Supernatan sel dari PBS diukur dengan spektro UV pada panjang
gelombang 280 nm untuk mendeteksi konsentrasi protein supernatan sel dan panjang gelombang 260 nm untuk mendeteksi adanya asam nukleat pada
supernatan sel. Konsentrasi protein dan asam nukleat pada supernatan kultur sel yang diberi bahan uji dibandingkan dengan konsentrasi protein dan asam nukleat
pada supernatan kultur sel yang tidak diberi bahan uji. Konsentrasi protein dan asam nukleat yang lebih tinggi pada supernatan kultur yang diberi bahan uji
dapat memprediksi terjadinya kebocoran membran sel Bunduki et al. 1995. Fenomena kebocoran membran sel dapat menjadi petunjuk mekanisme
terjadinya kematian sel.
c. Pengujian Aktivitas Serin Protease Bergmeyer 1983
