BAHAN DAN METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan pada beberapa laboratorium, yaitu : laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia pada Pusat Penelitian Ilmu Hayati dan
Bioteknologi Institut Pertanian Bogor, laboratorium Imunologi, Kultur jaringan, Embriologi, Histologi serta laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan
Institut Pertanian Bogor. Penelitian penunjang dilaksanakan pada laboratorium Kimia Balai pasca panen Balitbio Bogor dan laboratorium Material Sains FMIPA
Universitas Indonesia. Penelitian ini berlangsung mulai bulan Juni 2004 sampai dengan Juli 2005.
B. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : Kitosan dengan derajat deasetilasi 85 DD85 diperoleh dari Sigma Chemical Co.C3646-25G
014K0674. Kitosan tersebut berasal dari kulit udang. Kitosan dengan derajat deasetilasi 70 DD70, dalam bentuk terlarut 1, merupakan produk hasil
penelitian Rochima 2005. Kitosan dengan derajat deasetilasi 90 dan 100 DD90 dan DD 100, dalam bentuk terlarut 1 diperoleh dari Seikagaku
Co.Tokyo, Jepang. Isolat bakteri Bacillus licheniformis MB2 yang berasal dari sumber air
panas di Tompaso Manado Sulawesi Utara, telah dipilah sebagai penghasil enzim kitosanase ekstraseluler merupakan koleksi dari Laboratorium Mikrobiologi
dan Biokimia Pusat Penelitian Ilmu Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor.
Presipitasi enzim dilakukan menggunakan amonium sulfat teknis. Pemurnian enzim kolom kromatografi hidrofobik dilakukan menggunakan matriks
Butyl Sepharose 4-Fast Flow yang diperoleh dari Sigma Chemical Co.
Oligomer kitosan D-glukosamin, dimer sampai heksamer yang digunakan sebagai standar dalam analisis dan fraksinasi HPLC diperoleh dari Seikagaku
Co.Tokyo, Jepang. Identifikasi komponen kitooligomer dilakukan menggunakan HPLC dengan detektor UV model 440 dual lamdha.
Pengujian immunoenhancer secara in vitro menggunakan kultur sel limfosit yang diisolasi dari darah responden laki-laki yang sehat. Galur sel kanker uji
29
yang digunakan adalah : KR4 lymphablastoid B yang merupakan koleksi US NAMRU 2, K562 chronic myelogenous leukimia, HeLa epytheloid carcinoma
cervix dan galur sel A549 lung carcinoma yang merupakan koleksi
laboratorium Kultur Jaringan FKH IPB. Media untuk bakteri diperoleh dari Oxoid. Ltd. Media RPMI 1640 untuk
kultur sel limfosit diperoleh dari Sigma Chemical Co dan Dulbecco’s modified eagle’s medium
DMEM untuk medium kultur sel kanker diperoleh dari Gibco Ltd. HEPES, penicillin, streptomycin, MTT and Fetal bovine serum FBS
diperoleh dari Sigma Chemical Co. Mitogen Concanavalin A dan Pokeweed diperoleh dari Sigma Chemical Co.
Sentrifus sel menggunakan alat sentrifus jenis swing dengan tipe CR412 dari Jouan. Perhitungan jumlah sel dengan metode trifan biru menggunakan
mikroskop dari Zeiss ID03 Germany dengan pembesaran 100 kali. Pengamatan dan foto sel menggunakan inverted microscope tipe 1X70 dari Olympus dengan
pembesaran lensa obyektif 100 kali. Pembacaan absorbansi jumlah sel menggunakan alat Microplate reader Benchmark dari Bio-Rad. Pengamatan
Scanning electron Microscope SEM menggunakan alat JSM-531OLV dari
JEOL. Fluorochrome-bis-benzimide trihydrochloride
Hoechst 33342 yang digunakan sebagai pewarna fluoresens untuk pengujian apoptosis sel diperoleh
dari Biomedical Inc Ohio. Pengamatan dan foto apoptosis menggunakan mikroskop fluoresens Nikon Eclipse E600 Japan dengan pembesaran lensa
obyektif 400 kali. Substrat kolagen dan enzim tripsin EC 3.4.21.4 yang berasal dari
pankreas sapi, digunakan untuk pengujian aktivitas enzim protease yang diperoleh dari Sigma Chemical Co.
C. Diagram Alir Penelitian
