Hasil Pengujian Penghambatan Proliferasi Sel HeLa Oleh Senyawa- senyawa Kitooligomer

71 dibandingkan dengan senyawa -senyawa kitooligomer hasil fraksinasi yang ternyata lebih toksik terhadap sel limfosit daripada kitosannya sendiri serta senyawa anti kanker 2-Bromo deoksi uridin. Gambar 25 berikut memperlihatkan perbedaan profil sel K562 setelah mengalami inkubasi selama 3 tiga hari dengan hidrolisat dan tanpa hidrolisat senyawa-senyawa kitooligomer. Sel K562 kontrol Sel K562 dengan hidrolisat AS 0.005 3j DD85 Gambar 25 Profil sel K562 hasil perbesaran lensa obyektif inverted microscope sebesar 100 kali. Hasil penelitian tentang mekanisme penghambatan poliferasi sel K562 chronic myelogenous leukemia dilaporkan oleh Shunji 2004 yang meneliti pengaruh pemberian smenospongin yang merupakan senyawa sesquiterpen aminoquinon yang diisolasi dari spong laut pada konsentrasi 3-15 mikromolar dapat menginduksi diferensiasi sel K562 menjadi eritroblast. Adanya smenospongin membuat siklus sel terhenti pada fase G1 fasetahap sel menyiapkan proses replikasi DNA.

3. Hasil Pengujian Penghambatan Proliferasi Sel HeLa Oleh Senyawa- senyawa Kitooligomer

Pengujian kemampuan penghambatan proliferasi sel HeLa Epithel Carsinoma Cervix oleh kitosan dan senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat serta senyawa-senyawa kitooligomer hasil fraksinasi trimer – heksamer telah dianalisis dengan metode MTT. Hasil pengujian memberi informasi bahwa pemberian sampel senyawa-senyawa kitooligomer memiliki aktivi tas penghambatan terhadap proses proliferasi sel HeLa. Preparat standar senyawa-senyawa kitooligomer murni dari Seikagaku Corp Jepang, menunjukkan aktivitas penghambatan tertinggi dicapai oleh senyawa kitooligomer dengan unit 72 tetramer sebesar 27.66. Tetapi aktivitas tersebut masih lebih rendah bila dibandingkan dengan aktivitas penghambatan proliferasi sel HeLa oleh senyawa kitooligomer heksamer 0,10 3j DD85 yang mencapai 31.72 Gambar 26. Keterangan : FBS 0.0085 1j DD85 = Hasil reaksi enzim Filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60 o C dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD85 selama 1 jam. FBS 0.0085 3j DD85 = Hasil reaksi enzim Filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60 o C dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD85 selama 3 jam. EM 0.0085 6j DD90 = Hasil reaksi enzim murni dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD 90, 6 jam EM 0.0085 9j DD90 = Hasil reaksi enzim murni dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD 90, 9 jam AS 0.0085 1j DD85 = hasil reaksi enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD85, 1 jam AS 0.10 3j DD85 = Hasil reaksi enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.10 Umg kitosan DD85, 3 jam. Br-d U = 2-Bromo deoksi uridin senyawa anti kanker komersial, Sigma Standar = Senyawa-senyawa kitooligomer murni dari Seikagaku Corp,Jepang. Gambar 26 Aktivitas senyawa-senyawa kitooligomer hasil fraksinasi sebagai penghambat proliferasi sel HeLa Aktivitas penghambatan sebesar 31.72 merupakan aktivitas penghambatan proliferasi yang tertinggi terhadap sel HeLa. Hal ini menunjukkan telah terjadi pengurangan jumlah sel sebesar 31.72 dari jumlah sel kontrol 1 x 10 5 selml. Data aktivitas senyawa kitooligomer heksamer tersebut didukung oleh laporan peneliti sebelumnya bahwa aktivitas anti kanker terbaik dari senyawa-senyawa kitooligo mer yang berasal dari kitin adalah adalah kitooligomer dengan unit heksamer Kobayashi et al. 1990; Suzuki et al. 1992 dan Suzuki 1996. Aktivitas penghambatan proliferasi dari kontrol positif senyawa anti kanker 2- Bromo deoksi uridin memiliki nilai sekitar 18,18 pada konsentrasi yang sama 17µgml kultur. Perbedaan aktivitas penghambatan tertinggi oleh senyawa kitooligomer heksamer 0.1 dengan kontrol positif mencapai nilai sekitar 15,15. Gambar 27 memperlihatkan aktivitas penghambatan proliferasi terhadap sel HeLa oleh hidrolisat yang mengandung senyawa-senyawa kitooligomer. - 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 EM 0.0085 6j DD90 EM 0.0085 9j DD90 AS 0.10 3j DD85 FBS 0.0085 1j DD85 FBS 0.0085 3j DD85 Standar Br-dU Senyawa-senyawa kitooligomer hasil fraksinasi Penghambatan proliferasi Trimer Tetramer Pentamer Heksamer 73 Keterangan : FBS 0.0085 1j DD85 = Hasil reaksi enzim Filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60 o C dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD85 selama 1 jam. FBS 0.0085 3j DD85 = Hasil reaksi enzim Filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60 o C dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD85 selama 3 jam. FBSMn 0.0085 1j DD85 = hasil reaksi enzim dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan yang ditambah katalisator MnCl 2 10 mM dengan kitosan DD85 selama 1 jam. AS 0.005 3j DD85 = Hasil reaksi enzim pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.005 Umg kitosan DD85, 3 jam. AS 0.0085 1j DD85 = hasil reaksi enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD85, 1 jam AS 0.10 3j DD85 = Hasil reaksi enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.10 Umg kitosan DD85, 3 jam. AS 0.17 3j DD85 = hasil reaksi enzim dengan dengan konsentrasi 0.17 Umg kitosan DD85, 3 jam EM 0.0085 6j DD90 = Hasil reaksi enzim murni deng an konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD 90, 6 jam EM 0.0085 9j DD90 = Hasil reaksi enzim murni dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD 90, 9 jam enz = enzim kitosanase glukosamin = unit monomer dari senyawa-senyawa kitooligomer. kit D D100 = Kitosan dengan derajat deasetilasi 100 kit D D70 = Kitosan dengan derajat deasetilasi 70 kit D D85 = Kitosan dengan derajat deasetilasi 85 kit D D90 = Kitosan dengan derajat deasetilasi 90 Br-du = 2-Bromo deoksi uridin senyawa anti kanker komersial, Sigma Gambar 27 Aktivitas senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat enzimatik pada penghambatan proliferasi sel HeLa Aktivitas penghambatan proliferasi terhadap sel HeLa oleh sampel senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat memperlihatkan aktivitas penghambatan tertinggi dimiliki oleh hidrolisat AS 0.005 3j DD85 hasil reaksi enzimatik yang berasal dari enzim hasil pekatan amonium sulfat 80 dengan aktivitas 0.005 unit per miligram kitosan DD85 sebesar 18.90, enzim kitosanase dan kitosan dengan derajat deasetilasi 100 memiliki aktivitas lebih tinggi daripada sampel hidrolisat yang lain, yaitu sebesar 21.24 untuk kitosan dan 21.66 untuk enzim. Hasil ini juga lebih tinggi daripada aktivitas penghambatan oleh kontrol positif senyawa anti kanker 2-Bromo deoksi uridin sebesar 18,18 pada nilai konsentrasi yang sama 17 µgml kultur. Hasil 5 10 15 20 25 FBS 0.0085 1j FBS 0.0085 3j FBsMn 0.0085 1j AS 0.005 3j DD85 AS 0.0085 1j DD85 AS 0.10 3j DD85 AS 017 3j DD85 EM 0.0085 6j DD90 EM 0.0085 9j DD90 enz glukosamin kit DD100 kit DD70 kit DD85 kit DD90 BrdU senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat Penghambatan proliferasi HeLa 74 pengujian pada sel HeLa memberi informasi bahwa senyawa-senyawa kitooligomer dalam berbagai hidrolisat hasil reaksi enzimatik memberikan respon penghambatan proliferasi sel yang lebih rendah dibandingkan dengan senyawa- senyawa kitooligomer hasil fraksinasi. Perbedaan nilai aktivitas penghambatan proliferasi antara sampel hidrolisat dan sampel hasil fraksinasi mencapai 12.82. Hal ini berarti bahwa sifat sitotoksik senyawa-senyawa kitooligomer terhadap sel HeLa semakin meningkat apabila senyawa kitooligomer yang diberikan adalah senyawa kitooligomer murni. Gambar 28 memperlihatkan perbedaan profil sel HeLa setelah mengalami inkubasi selama 3 tiga hari dengan sampel hidrolisat yang mengandung senyawa-senyawa kitooligomer dan tanpa sampel hidrolisat sebagai kontrol. Sel Hela kontrol Sel HeLa denganhidrolisat AS 0.005 3j DD85 Gambar 28 Profil sel HeLa hasil perbesaran lensa obyektif inverted microscope sebesar 100 kali. Penelitian terhadap penghambatan proliferasi sel HeLa, telah dilakukan oleh beberapa peneliti sebelumnya, antara lain: Prise et al. 1986 meneliti tentang penghambatan sel HeLa melalui pemberian 100 mikromolar metotrexat dengan lama inkubasi lebih dari 24 jam. Chen et al. 2003 meneliti Artemisinin turunan senyawa artesunat ART dan dihidroartemisinin, keduanya merupakan obat anti-malaria yang ditemukan dapat menghambat pertumbuhan kanker serviks HeLa dengan mekan isme penekanan terhadap proses angiogenesis, dengan nilai LC50 berkisar 15.4 sampai 49.7 molar. 4. Hasil Pengujian Penghambatan Proliferasi Sel A549 Oleh Senyawa-senyawa Kitooligomer Pengujian kemampuan penghambatan proliferasi sel A549 Lung carcinoma oleh kitosan dan senyawa -senyawa kitooligomer dalam hidrolisat 75 reaksi enzimatik serta senyawa-senyawa kitooligomer hasil fraksinasi trimer – heksamer telah dianalisis dengan metode MTT. Hasil pengujian menunjukkan bahwa pemberian senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat dan hasil fraksinasi memiliki aktivitas penghambatan terhadap proses proliferasi sel A549. Gambar 29 berikut memperlihatkan aktivitas penghambatan proliferasi sel A549 oleh senyawa kitooligomer hasil fraksinasi. Keterangan : Fbsp1jDD85 = hasil reaksi enzim Filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60 o C dengan unit 0.0085 Umg kitosan DD85 selama 1jam. Fbsp3jDD85 = hasil reaksi enzim Filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60 o C dengan unit 0.0085 Umg kitosan DD85 selama 3 jam. EM6j DD90 = Hasil reaksi enzim murni dengan unit 0.0085 Umg kitosan DD 90, 6 jam EM9 DD90 = Hasil reaksi enzim murni dengan unit 0.0085 Umg kitosan DD 90, 9 jam 0.1 3j DD85 = Hasil reaksi enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan unit 0.10 Umg kitosan DD85, 3 jam. Gambar 29 Aktivitas senyawa-senyawa kitooligomer hasil fraksinasi pada penghambatan proliferasi sel A549 Pengujian preparat standar senyawa-senyawa kitooligomer murni dari Seikagaku Corp. Jepang memperlihatkan adanya aktivitas penghambatan tertingi oleh senyawa kitooligomer dengan unit trimer sebesar 22.72. Aktivitas ini hampir sama dengan aktivitas penghambatan proliferasi oleh senyawa kitooligomer tri mer dari hidrolisat EM 0.0085 9j DD90 hasil reaksi enzim murni dengan aktivitas 0.0085 unit per miligram kitosan dengan substrat kitosan DD 90 selama 9 jam sebesar 22.70 yang merupakan aktivitas penghambatan tertinggi terhadap sel A549. Hal ini berarti telah terjadi pengurangan jumlah sel sebesar 22.70 dari jumlah sel kontrol 1 x 10 5 selml. Respon aktivitas penghambatan proliferasi terhadap sel A549 oleh kontrol positif senyawa anti 5 10 15 20 25 30 EM 0.0085 6j DD90 EM 0.0085 9j DD90 AS 0.10 3j DD85 FBS 0.0085 1j DD85 FBS 0.0085 3j DD85 Standar Br-du Senyawa kitooligomer hasil fraksinasi hidrolisat enzimatik Penghambatan proliferasi Trimer Tetramer Pentamer Heksamer 76 kanker 2-Bromo deoksi uridin memiliki nilai 6.75 pada konsentrasi yang sama 17µgml kultur. Perbedaan aktivitas penghambatan tertinggi pada sampel trimer EM 0.0085 9j DD90 dengan kontrol positif mencapai 15.95. Pada Gambar 30 diperlihatkan aktivitas penghambatan proliferasi sel A549 oleh sampel hidrolisat enzimatik yang mengandung senyawa-senyawa kitooligomer. Keterangan : AS 0.0085 1j DD = hasil reaksi enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD85, 1 jam enz = enzim kitosanase glukosamin = unit monomer dari senyawa-senyawa kitooligomer. Br-Du = 2-Bromo deoksi uridin senyawa anti kanker komersial, Sigma Gambar 30 Aktivitas senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat dan senyawa pembanding pada penghambatan proliferasi sel A549. Kemampuan senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat pada Gambar 30 memperlihatkan hanya hidrolisat AS 0.0085 1j DD85 hasil reaksi enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan unit aktivitas 0.0085 unit per miligram kitosan dengan substrat kitosan DD 85 selama 1 jam yang memperlihatkan adanya aktivitas penghambatan proliferasi terhadap sel A549 sebesar 2.87. Enzim kitosanase dan glukosamin serta kontrol positif senyawa anti kanker 2-Bromo deoksi uridin ternyata memiliki aktivitas penghambatan proliferasi yang lebih besar daripada hidrolisat AS 0.0085 1j DD85, yaitu sebesar 34.56 untuk enzim dan 6.47 untuk glukosamin serta 6.75 untuk 2-Bromo deoksi uridin pada konsentrasi yang sama 17 µgml kultur. Hasil pengujian pada sel A549 pada gambar 29 dan 30 memberi informasi bahwa senyawa-senyawa kitooligomer dari berbagai hidrolisat reaksi enzimatik memberikan respon penghambatan proliferasi sel yang sangat rendah dibandingkan senyawa-senyawa kitooligomer hasil fraksinasi trimer EM 0.0085 9j DD90 dengan perbedaan aktivitas penghambatan mencapai sekitar 19.83. 5 10 15 20 25 30 35 40 AS 0,0085 1j DD85 enz glukosamin Br-DU Kitooligomer dalam hidrolisat dan senyawa pembanding Ppenghambatan proliferasi A549 77 Senyawa kitooligomer hasil fraksinasi trimer EM 0.0085 9j DD90 juga memberikan respon penghambatan proliferasi sel A549 yang lebih baik dari kontrol positif senyawa anti kanker 2-Bromo deoksi uridin. Respon penghambatan proliferasi senyawa kitooligomer dengan unit trimer dari hidrolisat EM 0.0085 9j DD90 memperlihatkan informasi tentang adanya aktivitas penghambatan proliferasi yang berbeda dari hasil yang telah dilaporkan oleh beberapa peneliti lain, bahwa aktivitas anti kanker terbaik dari senyawa kitooligomer yang berasal dari kitin adalah adalah kitooligomer dengan unit heksamer Kobayashi et al. 1990; Suzuki et al. 1992 dan Suzuki 1996. Gambar 31 berikut memperlihatkan perbedaan profil sel A549 setelah mengalami inkubasi 3 hari dengan sampel hidrolisat dan tanpa sampel hidrolisat yang mengandung senyawa-senyawa kitooligomer kontrol. Sel A549 kontrol Sel A549 dengan hidrolisat AS 0.0085 1j DD85 Gambar 31 Profil sel A549 hasil perbesaran lensa obyektif inverted microscope sebesar 100 kali. Hasil-hasil penelitian terhadap penghambatan proliferasi sel A549 antara lain dilaporkan oleh Akihisa et al. 2001, tentang aktivitas anti tumor dari fenoxazinon, 2-amino-4,4-dihidro-4[alfa],7-dimetil-3H-fenoxazin-3-one Phx yang disintesis dari reaksi 2-amino-5-metilfenol dengan hemoglobin sapi terhadap sel A549 menunjukkan aktivitas penekanan proses proliferasi dan menginduksi kematian sel apoptosis dengan memfragmentasi DNA. Park et al. 2004 meneliti wikyungtang WKT sebuah formula herbal yang diketahui memiliki aktivitas anti inflamasi dan anti tumor. Pengujian WKT pada sel-sel A549 ternyata menginduksi apoptosis dengan cara mengaktivasi caspase protease dan menurunkan ekspresi senyawa anti apoptosis Bcl-X L serta menghambat ekspresi siklooksigenase-2 COX-2. 78

E. Mekanisme Penghambatan Proliferasi Sel Kanker oleh Senyawa-senyawa Kitooligomer