23
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan bersifat eksperimental murni menggunakan metode desain faktorial dengan dua faktor dan dua level, yaitu untuk melihat
pengaruh Tween 80 sebagai surfaktan dan PEG 4000 sebagai basis dalam formula krim.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel Penelitian
a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah komposisi Tween 80 sebagai
surfaktan dan PEG 4000 sebagai basis dalam formula krim.
b. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sifat fisik serta stabilitas
fisik krim yang meliputi: daya sebar, viskositas, pergeseran viskositas, dan analisis ukuran droplet.
c. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi
penyimpanan, lama pengadukan, dan kecepatan pencampuran.
d. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah suhu
ruangan dan kelembaban udara.
2. Definisi Operasional
a. Krim ekstrak etil asetat tomat adalah sediaan setengah padat yang mengandung tomat sebagai bahan aktif yang diekstraksikan menggunakan
pelarut etil asetat. b. Basis adalah bahan dasar krim yang menentukan sifat dasar dari krim dan
menentukan keberhasilan atau kegagalan terapi. Basis yang digunakan dalam penelitian ini adalah PEG 4000.
c. Surfaktan merupakan bahan yang digunakan dalam membentuk emulsi dengan cara menurunkan tegangan permukaan, surfaktan yang digunakan
adalah Tween 80. d. Sifat fisis krim adalah parameter yang digunakan untuk mengetahui kualitas
fisik krim, dalam penelitian ini meliputi pengamatan organoleptis, pengamatan homogenitas, viskositas, daya sebar.
e. Stabilitas fisis krim merupakan parameter untuk mengetahui tingkat kestabilan krim secara periodik dalam jangka waktu 1 bulan, dalam hal ini
meliputi pergeseran viskositas, pengamatan diameter globul rata-rata. f. Distribusi ukuran droplet merupakan salah satu sifat fisis krim yang
dievaluasi dengan menggunakan ukuran distribusi statistik. g. Daya sebar adalah kemampuan penyebaran krim saat diaplikasikan pada
kulit, dapat diukur dengan aplikasi beban 125 gram selama 1 menit. Nilai daya sebar yang diharapkan pada penelitian ini adalah 5-7 cm.
h. Viskositas adalah parameter ketahanan krim ekstrak etil asetat tomat untuk mengalir setelah adanya pemberian gaya.
i. Pergeseran viskositas adalah presentase selisih viskositas sediaan krim setelah penyimpanan selama 1 bulan dengan viskositas rata-rata 48 jam
setelah pembuatan terhadap viskositas rata-rata 48 jam setelah pembuatan. Nilai pergeseran viskositas optimal yang diharapkan pada penelitian ini
kurang dari 10. j. Desain faktorial merupakan metode optimasi yang digunakan untuk
mengetahui efek yang dominan dalam sifat fisis dan stabilitas krim melalui analisis hasil secara statistik.
k. Faktor adalah variabel yang diteliti dalam penelitian, dalam hal ini adalah Tween 80 dan PEG 4000.
l. Level adalah tingkatan komposisi dari rancangan desain faktorial terdiri atas level tinggi dan level rendah.
m. Respon adalah nilai yang terukur yang didapat dari hasil percobaan menggunakan metode desain faktorial.
n. Efek merupakan perubahan respon yang disebabkan variasi level dan faktor. o. Contour plot adalah profil respon distribusi ukuran droplet dan viskositas
krim ekstrak tomat. p. Contour plot superimposed adalah gabungan dari semua contour plot yang
dapat diguanakan untuk menentukan ada tidaknya prediksi komposisi formula optimum krim ekstrak tomat.
1. Bahan penelitian
Tomat, etil asetat, metil paraben nipa
2. Alat penelitian
Alat-alat gelas PY Sediaan Padat – S
Laboratorium Form pengukur daya seb
Padat – Semi P Laboratorium Form
vacuum rotary evaporat
Ekstraksi
Uji pH U
e
C. Bahan dan Alat Penelitian an
at, talcum, PEG 4000, Tween 80, asam stearat, nipagin, trietanolamin TEA, aquadest, NaOH, N
PYREX
®
- GERMANY Laboratorium Form – Semi Padat USD, waterbath GERHARDT
ormulasi Teknologi Sediaan Padat – Semi Pa sebar modifikasi Laboratorium Formulasi Teknol
Padat USD, viskotester seri VT-04 R ormulasi Teknologi Sediaan Padat – Semi Pada
vaporator.
D. Tata Cara Penelitian
Gambar 2. Skema alur penelitian
Desain formula dengan rancangan desain f
Pembuatan Krim
Uji sifat fisis dan stabilitas sediaan
krim Uji tipe
emulsi Uji daya
sebar Uji
viskositas Uji HET
CAM
at, propilen glikol, H, NaCl, DPPH.
ormulasi Teknologi DT
®
-GERMANY Padat USD, alat
Teknologi Sediaan RHION
®
-JAPAN adat USD, mixer,
in faktorial
Uji distribusi ukuran
droplet ET-
M
1. Ekstraksi
Tomat segar dihaluskan dan dimaserasi dengan menggunakan pelarut etil asetat serta digojog dan didiamkan selama satu hari. Setelah satu hari,
campuran tomat dan etil asetat disaring dengan penyaring dan corong Buchner yang diberi kertas saring. Hasil saringan dipisahkan dengan corong pisah dan
diambil fase bagian atas, lalu dimasukkan ke dalam labu alas bulat dan dievaporasi dengan vacuum rotary evaporator pada suhu 70° C agar semua
pelarut dapat terpisah dan didapatkan ekstrak kental. Hasil evaporasi diambil setelah tidak ada pelarut yang menetes, lalu dimasukkan ke dalam beaker glass
dan diberi talcum dan dicampur hingga homogen dan terbentuk ekstrak kering.
2. Uji Aktivitas Antioksidan dengan Uji Semprot DPPH
Ekstrak cair diletakkan di atas kertas Whattman, lalu disemprot dengan larutan DPPH 0,2 hingga warna ungu dari DPPH hilang dan menjadi warna
kuning Elya, Dewi dan Budiman, 2013.
3. Desain Formula
Formula dasar yang digunakan dalam pembuatan krim ekstrak tomat ini mengacu pada pembuatan krim tipe minyak dalam air ma dengan
penyusunan formula seperti pada tabel II.
Tabel II. Formula dasar krim tipe minyak dalam air ma Anonim, 1971.
Bahan Dasar Krim I
Dasar Krim II Asam stearat
Trietanolamin Adeps lanae
Parafin cair Gliserol
Boraks Nipagin
Nipasol Air suling hingga
14,5 g 1,5 g
3 g 25 g
- -
0,1 g 0,05 g
100 ml 14,2 g
1 g -
- 10 g
0,25 g 0,1 g
0,05 g 100 ml
Dalam optimasi formula ini dilakukan modifikasi formula sebagai berikut:
a. Asam stearat 20 gram
Triethanolamine 1,35 gram
b. PEG 4000 4 gram
Tween 80 5 gram
Nipagin 0,2 gram
Propilen Glikol 5 gram
Aquadest 60 ml c. Ekstrak Tomat 6 gram
Tabel III. Formula krim ekstrak etil asetat tomat
Formula 1
A b
ab Asam Stearat
20 20
20 20
Triethanolamine 1,35
1,35 1,35
1,35 PEG 4000
2 2
6 6
Tween 80 3
7 3
7 Nipagin
0,2 0,2
0,2 0,2
Propilen Glikol 5
5 5
5 Aquadest
60 60
60 60
Ekstrak Tomat 6
6 6
6 Jumlah
97,55 101,55
101,55 105,55
4. Pembuatan Krim
Fase minyak asam stearat dipanaskan dalam cawan porselen pada suhu 70°C. Fase air PEG 4000,
Tween 80, nipagin, propilen glikol,
triethanolamine dipanaskan pada suhu 70°C. Aquadest dipanaskan dan dituang dalam fase air dan dicampur dengan mixer hingga homogen. Fase
minyak dimasukkan dalam fase air sedikit demi sedikit, dicampur dengan mixer hingga homogen. Ekstrak tomat dimasukkan ke dalam krim, kemudian
dicampur dengan mixer hingga homogen.
5. Uji HET-CAM
a. Penyiapan Telur. Telur yang digunakan merupakan telur ayam kampung yang telah tumbuh menjadi embrio kira-kira berumur 8-12 hari. Telur
dipilih dengan cangkang putih dan dengan keadaan yang fertil, segar serta bersih. Kemudian buka cangkang telur pada bagian yang memiliki rongga
udara yang selanjutnya akan digunakan untuk tempat menyuntikkan bahan. Suntikan dilakukan pada daerah membran yang dekat dengan pembuluh
darah. b. Kontrol Positif NaOH 0,1 N. Ditimbang sebanyak 0,4 gram NaOH padat,
kemudian dilarutkan dengan aquadest lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan diadd aquadest hingga tanda.
c. Kontrol Negatif 0,9 NaCl. Ditimbang sebanyak 0,9 gram NaCl padat, kemudian dilarutkan dengan aquadest lalu dimasukkan ke dalam labu ukur
100 ml dan diadd aquadest hingga tanda.
d. Perlakuan. Telur-telur yang telah dibuka cangkangnya diberi perlakuan sebagai berikut:
1. Diberi NaOH sebanyak 0,3 ml. 2. Diberi NaCl sebanyak 0,3 ml.
3. Diberi krim ekstrak tomat yang telah dibuat F1, Fa, Fb, Fab sebanyak 0,3 gram.
Setiap perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali replikasi, lalu diamati perubahannya hingga 300 detik.
e. Pengamatan. Pengamatan dilakukan dengan mengamati perubahan
pembuluh darah pada CAM. Pengamatan reaksi CAM dilakukan selama 300 detik. Waktu munculnya gejala diamatai dan dicatat waktunya. Gejala-
gejala yang diamati adalah hemoragi pendarahan, vascular lysis disintegrasi pemvuluh darah dan koagulasi denaturasi protein ekstra dan
intra vaskular. Hasil yang diperoleh digambarkan dalam bentuk skoring dengan menggunakan rumus Irritation Score IS:
IS = x 5 +
7 + 9
Anonim, 2006. Hemorrhage time dimulai dalam detik reaksi hemoragi atau pendarahan
pada CAM. Lysis time dimulai dalam detik lisis pembuluh darah hingga pembuluh darah hilang pada CAM. Coagulation time dimulai dalam detik
pembentukan koagulan pada CAM.
Setelah perlakuan selama 300 detik, lalu dilakukan perhitungan IS dan ditentukan kategori iritasi untuk semua perlakuan menurut skor yang
didapat, sesuai tabel IV. Jika pada perlakuan tidak terjadi hemoragi, lisis atau koagulasi hingga akhir pengamatan, maka diberi angka 301 untuk
waktunya.
Tabel IV. Skor hasil uji iritasi HET-CAM HET-CAM Score Range
Irritation Category
0 – 0,9 Nonirritant or Practically None
1 – 4,9 Weak or Slight Irritation
5 – 8,9 atau 5 – 9,9 Moderate Irritation
9 -21 atau 10 - 21 Strong or Severe Irritation
6. Uji Sifat Fisik dan Stabilitas Sediaan Krim
a. Uji Organoleptis dan pH. Uji organoleptis dilakukan dengan mengamati bau dan warna krim 48 jam setelah pembuatan. Pengukuran pH dilakukan
dengan bantuan pH universal pH stick dengan cara memasukkannya ke dalam sediaan dan membandingkan warna dengan standar.
b. Pengujian Daya Sebar. Ditimbang krim seberat 1 gram dan diletakkan di tengah kaca bulat berskala. Di atas krim diletakkan kaca bulat lain dan
pemberat dengan berat total 125 gram, didiamkan selama 1 menit, dicatat diameter penyebarannya.
c. Uji Viskositas. Pengukuran viskositas menggunakan Viscotester Rhion seri VT-04 dengan menggunakan rotor nomor 1 yang penggunaannya dengan
cara: krim dimasukkan dalam wadah dan dipasang pada portable viscotester. Viskositas krim diketahui dengan mengamati gerakan jarum
penunjuk viskositas. Pengukuran viskositas dilakukan segera setelah 48 jam pembuatan serta 1 bulan setelah penyimpanan.
d. Pengujian Distribusi Ukuran Droplet. Mikroskop dipersiapkan dan lensa dikalibrasi. Tiap formula dipreparasi di objek gelas. Ukuran droplet diukur
dan diklasifikasikan sesuai range ukuran droplet yang telah ditentukan dari hasil pengukuran 500 droplet. Pengamatan terhadap ukuran droplet
dilakukan segera setelah pembuatan dan selama 1 bulan penyimpanan. e. Pengujian Tipe Emulsi Metode Warna. Beberapa tetes methylen blue
dicampurkan ke dalam suatu formula krim. Jika seluruh krim berwarna seragam, maka terdapat suatu emulsi dari jenis ma, oleh karena air adalah
fase luar Voigt, 1994.
E. Optimasi dan Analisis Hasil
Data sifat fisis dan stabilitas yang terkumpul dianalisis dengan menggunakan metode desain faktorial. Dibuat profil sifat fisis viskositas dan
stabilitas pergeseran viskositas dan stabilitas fase emulsi krim berdasarkan persamaan desain faktorial Bolton, 1997.
Data yang terkumpul dihitung dengan metode perhitungan desain faktorial untuk mengetahui efek PEG 4000, Tween 80 dan interaksinya. Dengan
pendekatan desain faktorial untuk menghitung koefisien dari b0, b1, b2, b12 sehingga diperoleh persamaan Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b12 X1X2. Dari
persamaan tersebut dapat dibuat contour plot sifat fisik krim ekstrak tomat. Dari masing-masing contour plot digabungkan menjadi contour plot superimposed
untuk mengetahui komposisi optimum dari PEG 4000 dan Tween 80 pada level yang diteliti. Analisis data dilakukan dengan bantuan perangkat lunak R 2.14.1
dengan berbagai uji statistik yang dilakukan, antara lain : Shapiro-Wilk untuk mengetahui normalitas distribusi data dan Levene’s Test untuk mengetahui
kesamaan varians. Apabila data yang diuji memenuhi persyaratan uji statistik parametrik, maka dilanjutkan uji ANOVA untuk melihat signifikan antar
kelompok data.
F. Validasi Formula
Kategori