Alur Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian 1. Tempat Penelitian Bahan Penelitian Besar Sampel Penelitian

B. Alur Penelitian

Diagram 3. Bagan Alur Penelitian Ekstrak bunga brokoli Brassica oleracea L. var. italica Plenck Uji fitokimia Uji sitotoksisitas terhadap sel fibroblas Hasil deskriptif analitik Uji penentuan ekspresi mRNA MMP-1 dan prokolagen tipe I pada kultur fibroblas Uji penghambatan photoaging Uji penentuan ekspresi protein MMP-1 dan prokolagen tipe I pada kultur fibroblas Universitas Sumatera Utara

C. Tempat dan Waktu Penelitian 1. Tempat Penelitian

a. Ekstraksi dan uji fitokimia dilakukan di laboratorium obat tradisional Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan. b. Uji penghambatan photoaging dan uji sitotoksisitas ekstrak bunga brokoli terhadap sel fibroblas kulit manusia dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu LPPT dan Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada UGM Yogyakarta. 2. Waktu Penelitian Penelitian dilakukan pada Juni 2010 sampai dengan Juli 2011.

D. Bahan Penelitian

Bahan untuk penelitian, adalah sebagai berikut: 1. Bahan untuk uji fitokimia adalah bunga brokoli yang ditanam dari suatu lahan kebun di Desa Rumah Berastagi, Kecamatan Berastagi, Kabupaten Karo, Propinsi Sumatera Utara. 2. Bahan untuk uji penghambatan photoaging adalah sel fibroblas dari kulit manusia yang berasal dari preputium yang mengalami pasase 3. 3. Bahan untuk uji sitotoksisitas adalah sel fibroblas dari jaringan kulit manusia yang berasal dari preputium yang mengalami pasase 3. Universitas Sumatera Utara

E. Kriteria Inklusi dan Eksklusi Bahan Penelitian 1. Uji fitokimia Ekstrak Bunga Brokoli

a. Kriteria Inklusi 1 Tanaman brokoli yang tumbuh pada suatu lahan kebun di Desa Rumah Berastagi, Kecamatan Berastagi, Kabupaten Karo, Propinsi Sumatera Utara. 2 Usia tanaman rerata dua bulan. 3 Semua bunga masih segar dan berwarna hijau. 4 Tanaman memiliki ciri-ciri fisik tumbuhan yang sama mengenai tinggi pohon, warna, aroma bunga, dan besar bunga. b. Kriteria eksklusi adalah: tanaman menggunakan pestisida.

2. Uji Penghambatan photoaging dan Uji Sitotoksisitas pada Kultur

Sel Fibroblas Kulit Manusia Bahan penelitian adalah sel fibroblas kulit manusia dalam kondisi terkontrol di LPPT UGM Yogyakarta.

F. Besar Sampel Penelitian

Besar sampel dihitung dengan rumus t-1 r-1 ≥ 15; t= jumlah kelompok perlakuan; r = jumlah pengulangan Federer, 1955. Pada penelitian ini untuk uji penghambatan photoaging, jumlah kelompok perlakuan ada 9 dan pada uji sitotoksisitas, jumlah kelompok perlakuan ada 11 sehingga diperlukan 3 pengulangan triplo untuk setiap kelompok perlakuan. Universitas Sumatera Utara G. Identifikasi Variabel dan Definisi Operasional Variabel 1. Uji Fitokimia Ekstrak Bunga Brokoli a. Identifikasi Variabel 1. Variabel bebas adalah bunga brokoli yang diekstraksi dengan etanol 96. 2. Variabel tergantung adalah golongan senyawa aktif yang terkandung di dalam ekstrak bunga brokoli. 3. Variabel terkendali adalah: Kadar air, kadar abu total, kadar abu tidak larut asam, kadar sari larut dalam air dan kadar sari larut dalam etanol. b. Definisi Operasional Variabel 1 Fitokimia atau senyawa kimia–hayati adalah bahan kimia yang diproduksi oleh tumbuh-tumbuhan yang memiliki efek yang berkaitan dengan kesehatan, tetapi bukan yang dianggap sebagai bahan makanan utama, seperti protein, karbohidrat, lemak, mineral, dan vitamin Dean, 1998. 2 Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut yang digunakan Dean, 1998. 3 Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari bahan baku simplisia bunga brokoli secara perkolasi yaitu dengan menggunakan pelarut etanol 96 di luar pengaruh cahaya matahari langsung. Kemudian, semua atau hampir semua pelarut diuapkan. Universitas Sumatera Utara Seluruh perkolat dipekatkan dengan menggunakan alat vacuum rotary evaporator rotavapor Dean, 1998. 4 Kadar air adalah suatu perhitungan yang akan memberikan gambaran kandungan air yang terdapat dalam bahan setelah dilakukan pengeringan Dean, 1998. 5 Kadar abu total adalah suatu perhitungan yang akan memberikan gambaran kandungan mineral internal dan eksternal yang terdapat dalam simplisia yang digunakan Dean, 1998. 6 Kadar abu tidak larut asam adalah suatu perhitungan yang akan memberikan gambaran kandungan mineral eksternal, dengan tujuan memberikan jaminan bahwa simplisia yang digunakan tidak terjadi pengotorankontaminasi dari luar Dean, 1998. 7 Kadar sari larut dalam air adalah penetapan kadar zat pada simplisia yang dapat tersari dengan pelarut air Dean, 1998. 8 Kadar sari larut dalam etanol adalah penetapan kadar zat pada simplisia yang dapat disari dengan etanol Dean, 1998. 2. Uji Penghambatan photoaging dengan Pengukuran Ekspresi MMP-1 dan Prokolagen Tipe I pada Tingkat mRNA dan Tingkat Protein a. Identifikasi Variabel 1 Variabel bebas adalah konsentrasi ekstrak bunga brokoli dan dosis sinar UVB. 2 Variabel tergantung adalah ekspresi mRNA MMP-1, ekspresi protein MMP-1, ekspresi mRNA prokolagen tipe I, dan ekspresi protein prokolagen tipe I. Universitas Sumatera Utara 3 Variabel terkendali adalah panjang gelombang sinar UVB dan media kultur dengan kondisi yang sama. b. Definisi Operasional Variabel 1 Ekspresi mRNA MMP-1 Definisi : ekspresi pada tingkat transkripsi gen dari enzim matriks metalloproteinase-1 yang bertanggung jawab utama pada degradasi kolagen Brennan, et al., 2003. Alat ukur : Real time – Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction Real time RT –PCR Cara ukur : pengukuran secara kuantitatif tingkat ekspresi gen mRNA MMP-1 Hasil ukur : gml 2 Ekspresi mRNA Prokolagen tipe I Definisi : ekspresi pada tingkat transkripsi gen dari prekursor kolagen yang dibentuk oleh fibroblas Yamauchi, et al., 1988 Alat ukur : Real time RT –PCR Cara ukur : pengukuran secara kuantitatif tingkat ekspresi gen mRNA prokolagen tipe I Hasil ukur : gml 3 Ekspresi Protein MMP-1 Definisi : ekspresi MMP-1 pada tingkat protein Alat ukur : Human MMP-1 ELISA Kit Boster Universitas Sumatera Utara Cara : reaksi antigen-antibodi Hasil ukur : ngml 4 Ekspresi Protein Prokolagen tipe I Definisi : Ekspresi prokolagen tipe I pada tingkat protein Alat ukur : Procollagen type I C-Peptide EIA Kit TaKaRa Cara : reaksi antigen-antibodi Hasil ukur : ngml 5 Sinar ultra violet B Definisi : sinar UVB dengan panjang gelombang 290-320nm Alat ukur : sumber UV digunakan Philips TL 20 W12 RS. Cara : penyinaran dengan UVB dosis 50mJcm 2 dan 100mJcm 2. 3. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Bunga Brokoli Terhadap Sel Fibroblas Kulit Manusia a. Identifikasi Variabel 1 Variabel bebas adalah konsentrasi ekstrak bunga brokoli. 2 Variabel tergantung adalah viabilitas sel fibroblas kulit manusia. 3 Variabel terkendali adalah kondisi lingkungan sel fibroblas, yaitu ruang steril. Sel fibroblas ditempatkan dalam media Dulbecco’s modified Eagle’s medium DMEM 10. b. Definisi Operasional Variabel 1 Konsentrasi ekstrak bunga brokoli adalah ekstrak yang dilarutkan dan diencerkan dengan media DMEM 10 yang dinyatakan dalam µgml. Universitas Sumatera Utara 2 Sel fibroblas berasal dari jaringan kulit manusia yang dibiakkan. 3 Viabilitas sel fibroblas dinilai berdasarkan nilai optical density OD setelah diberi paparan ekstrak bunga brokoli pada uji MTT Dimethylthiazol Diphenyl Tetrazolium . Sel-sel yang hidup akan memecahkan cincin tetrazolium yang berwarna kuning pucat dan kemudian membentuk kristal formazan yang berwarna ungu Patters, 1979. Rumus yang digunakan adalah sebagai berikut: OD kontrol – OD sampel OD kontrol

H. Bahan, Alat, dan Cara Kerja Penelitian 1. Tahap Penyediaan Simplisia