Pembuatan Kultur Primer Sel Fibroblas

5. Pembuatan Kultur Primer Sel Fibroblas

a. Bahan Bahan untuk pembuatan kultur primer sel fibroblas adalah preputium hasil sirkumsisi yang merupakan bahan biologik tersimpan BBT di LPPT UGM Yogyakarta. b. Alat Alat isolasi jaringan dan pembuatan kultur sel adalah: vertical laminar flow hood lemari kerja steril, pisau bedah, gunting, pinset, deck glass, pipet mikro, cawan petri atau reservoir, flask kultur, plat biakan sumur - 28 dan sumur- 96 28 96 - microtiter tissue plate , pipettor,inkubator CO2, tabung sentrifus, dan alat sentrifus. c. Cara Kerja Wise Jones, 1997 Cuci jaringan dengan PBS steril sebanyak 2-3 kali dalam petri dish , kemudian dipotong-potong kurang lebih 1cm. Bersihkan kulit arinya dengan cara dikerok sampai bersih, dan kemudian pindahkan ke petri lain yang sudah berisi phospate buffer saline PBS atau medium Roswell Park Memorial Institute Medium RPMI. Pisahkan antara dermis dan epidermis dengan cara dikerok sampai epidermisnya hilang terlihat putih, pindahkan ke petri lain yang sudah ada medium RPMI. Dermis dipotong- potong sampai kecil-kecil, ditata di petri kecil, dan ditutup dengan deck glass steril. Selanjutnya, tambahkan medium komplit DMEM 10 sebanyak 2-3ml dan diinkubasikan dalam inkubator CO2 dengan suhu 37 C. Setiap 2-3 hari sekali diamati dan diganti mediumnya. Setelah sel keluar dari jaringan Universitas Sumatera Utara dan sampai konfluen, ambil jaringan satu demi satu. Setelah itu, tambahkan medium DMEM dan cuci sisa-sisa debris atau jaringan yang ada. Kemudian, tambahkan medium komplit DMEM 10, inkubasi sampai semua permukaan petri penuh dengan sel. Akhirnya sel siap dipanen dan disubkulturkan ke flask. 6. Uji Penghambatan photoaging dengan Pengukuran Ekspresi MMP-1 dan Prokolagen Tipe I pada Tingkat mRNA dan Tingkat Protein a. Bahan 1 Bahan penelitian adalah sel fibroblas kulit manusia. Kultur sel dibuat dan dipelihara dalam kondisi terkontrol di LPPT UGM Yogyakarta. 2 Bahan utama adalah ekstrak bunga brokoli. b. Bahan Penunjang 1 Allprep TM DNARNAprotein Qiagen kit untuk isolasi RNA. 2 Transcriptor First strand cDNA synthesis kit Roche untuk mengubah RNA ke cDNA. 3 Human MMP-1 ELISA Kit Boster untuk penentuan ekspresi protein MMP-1. 4 Procollagen type I C-Peptide EIA Kit TaKaRa untuk penentuan ekspresi protein prokolagen tipe I. c. Alat 1 Sinar UVB untuk membuat efek penuaan buatan pada sel fibroblas kulit manusia. 2 Alat pemeriksaan untuk penentuan ekspresi mRNA MMP-1 dan mRNA prokolagen tipe I adalah Real-time RT-PCR Light Cycler 1,2 Roche. Universitas Sumatera Utara c. Cara Kerja 1 Perlakuan dengan Ekstrak Bunga Brokoli a Sebanyak 250l suspensi sel fibroblas dalam medium lengkap ditanamkan pada 3 buah 24 well microplate 1 untuk kelompok tanpa UVB, 1 untuk kelompok UVB 50mJcm 2 , dan 1 untuk kelompok UVB100 mJcm 2 dengan tiap well mengandung 2 x 10 6 ml fibroblas. b Sel di pre-treatment dengan berbagai konsentrasi ekstrak bunga brokoli 25, 50, 100gml sebanyak 250l tiap well selama 24 jam, dan kemudian disinari UVB kecuali pada kelompok I sesuai tabel di bawah. Kelompok Dosis UVB mJcm 2 Ekstrak bunga brokoli gml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 - 50 50 50 50 100 100 100 100 - - 25 50 100 - 25 50 100 Universitas Sumatera Utara c Selanjutnya diinkubasi selama 72 jam. d Setelah itu sel dipanen untuk bahan pemeriksaan isolasi RNA dan dilanjutkan dengan Real-time RT-PCR untuk pengukuran ekspresi mRNA MMP-1 dan prokolagen tipe I. Supernatan digunakan untuk bahan pemeriksaan ekspresi protein MMP-1 dengan ELISA dan ekspresi prokolagen tipe I dengan EIA. 2 Penentuan Ekspresi mRNA MMP-1 dan Prokolagen Tipe I. a Isolasi RNA dari kultur sel fibroblas Isolasi RNA dari kultur sel fibroblas menggunakan Allprep TM DNARNAProtein, Qiagen ® Germany. Konsentrasi RNA dikuantifikasi dengan spektrofotometer UV pada 260nm dan kemurniannya ditentukan dengan menggunakan absorben pada panjang gelombang 260nm A 260 dan 280nm A 280. b Real Time RT-PCR Pada Real Time RT-PCR dilakukan reverse-transcriptase dengan Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit Roche yang meliputi Transcriptor Reverse Transcriptase, 10 x RT-PCR Buffer, dNTP mix, Oligo d T 18, dan R Nase Inhibitor . Complimentary DNA cDNA diamplifikasi dengan menggunakan program denaturasi pada 94 o C selama 30 detik, annealing pada 60 o C selama 30 detik dan elongasi pada 72 o C selama 30 detik. Selanjutnya dari cDNA, dilakukan sebanyak 35 siklus dengan Universitas Sumatera Utara menggunakan Light Cycler 1,2 Roche dan format deteksi SYBR Green I Applied Biosystem, Roster City, CA. Oligo dT-primed cDNA sebanyak 2µl diamplifikasi oleh PCR dalam 20µl reaksi mix yang mengandung 9µl water PCR grade, 2µl Primer dan 4µl SYBR® Green PCR Master Mix. Kuantifikasi absolut dilakukan dengan adanya sinyal fluorescence dari sampel yang membentuk kurva sigmoid kurva PCR. Sequence oligonukleotida yang digunakan adalah sebagai berikut: human MMP-1 sense primer, 5’ – AAG CGT GTG ACA GTA AGC-TA 3’; anti sense primer, 5’ - AAC CGG ACT TCA TCT CTG-3’; human procollagen-I sense primer , 5’-CTC GAG GTG GAC ACC ACC CT-3’, anti sense primer 5’-CAG CTG GAT GGC CAC ATC GG-3’, 3 Penentuan ekspresi protein MMP-1 dan prokolagen tipe I Dari supernatan sampel dilakukan pemeriksaan dengan menggunakan Human MMP-1 ELISA Kit Boster Biological Technology Ltd, China untuk penentuan ekspresi protein MMP-1 dan Procollagen tipe I C peptide EIA Kit TaKaRa Biomedicals Inc. Japan untuk penentuan ekspresi protein prokolagen tipe I. Kemudian, dibaca dengan absorbansi OD 450nm pada microplate reader. Universitas Sumatera Utara d. Diagram Kerja Uji Penghambatan photoaging Kelompok Dosis UVB mJcm 2 Ekstrak bunga brokoli gml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 - 50 50 50 50 100 100 100 100 - - 25 50 100 - 25 50 100 Diagram 7. Bagan Diagram Kerja Uji Penghambatan Photoaging Real time – Reverse transcriptase PCR - Ekspresi mRNA MMP-1 - Ekspresi mRNA prokolagen tipe I Isolasi RNA - ELISA human MMP-1 - EIA prokolagen tipe I - Ekspresi protein MMP-1 - Ekspresi prokolagen tipe I Supernatan Universitas Sumatera Utara

7. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Bunga Brokoli terhadap Sel Fibroblas Kulit Manusia