Menurut Ou et al. 2002, pengukuran antioksidan dengan metode FRAP dapat berjalan akurat apabila dilakukan pada senyawaan antioksidan yang bisa
mereduksi FeIIITPTZ pada kodisi reaksi secara termodinamika dan memiliki laju reaksi yang cukup cepat Widyastuti, 2010.
3. Metode CUPRAC Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity Prinsip dari uji CUPRAC Cupric Ion Reducing Antioxidant Capasity adalah
pembentukan kelat oleh bis neokropin tembaga II menggunakan pereaksi redoks kromogenik pada pH 7. Absorbansi dari pembentukan kelat CuI
merupakan hasil reaksi redoks dengan mereduksi polifenol yang diukur pada panjang gelombang 450 nm. Reaksinya sebagai berikut :
nCuNc
2 2+
+ A
r
OHn nCuNc
2 +
+ A
r
=On + nH
+
Apak et al, 2007 Kelebihan dari metode CUPRAC adalah pereaksi yang digunakan cukup
cepat bekerja, selektif, lebih stabil, mudah didapatkan dan mudah untuk diaplikasikan Erawati, 2002
Beberapa nilai
IC
50
untuk senyawa
antioksidan mgmL:
: Asam askorbat
:1,96+-0,013 Alpa-tokoferol
:7,3+-0,308 Sayur-sayuran
:4,7 Gamma oryzanol
:50+-0,0408 Pohon pinus OPC
:4,0 –13,5
Quercetin :2,457+-0,192
Asam ferulat FRAC :31,3 +-0,327 Hesperidin
:500 Ronald,2004
2.6 Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometer adalah alat yang terdiri dari spektometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang
tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang Khopkar, 2007.
Universitas Sumatera Utara
Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorpsi oleh sampel. Sinar
ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan elektron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV-
Vis biasanya digunakan untuk molekul atau ion anorganik atau kompleks di dalam larutan. Spektrum UV-Vis mempunyai bentuk yang lebar dan hanya sedikit
informasi tentang struktur yang bisa didapatkan dari spektrum ini. Tetapi spektrum ini sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari
analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Berr. Sinar ultraviolet
berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800 nm Rohman, 2007.
Prinsip dari alat ini radiasi pada rentang panjang gelombang 400-800 nm dilewatkan melalui suatu larutan senyawa. Elektron-elektron pada ikatan didalam
molekul menjadi tereksitasi sehingga menempati keadaan kuantum yang lebih tinggi dan dalam proses menyerap sejumlah energi yang melewati larutan
tersebut. Semakin longgar elektron tersebut ditahan di dalam ikatan molekul, semakin panjang gelombang energi lebih rendah radiasi yang diserap
Dachriyanus, 2004.
2.7 Bakteri
Bakteri adalah mikroorganisme bersel tunggal yang tidak terlihat oleh mata,tetapi dapat dilihat dengan bantuan mikroskop. Ukuran bakteri berkisar antara panjang
0,5 sampai 10µ dan lebar 0,5 sampai 2,5µ µ = 1 mikron = 0,001mm tergantung dari jenisnya. Bakteri terdapat secara luas dilingkungan alam yang berhubungan
dangan hewan, udara, air dan tanah Buckle, 2007. Mikroorganisme memang peranan penting dalam menganalisis sistem
enzim dan dalam mengalisis komposisi suatu makanan. Bakteri merupakan organisme yang sangat kecil berukuran mikroskopis. Bakteri rata-rata berukuran
lebar 0,5 – 1 mikron dan panjang hingga 10 mikron 1 mikron - ͳͲ
ଷ
mm. Untuk melihat bakteri dengan jelas, tubuhnya perlu diisi dengan zat warna, pewarna ini
disebut pengecatan bakteri.
Universitas Sumatera Utara
Cat yang umum dipakai adalah cat Gram. Diantara bermacam-macam bakteri yang dicat, ada yang dapat menahan zat warna ungu dalam tubuhnya
meskipun telah didekolorisasi dengan alkohol dan aseton. Dengan demikian tubuh bakteri itu tetap berwarna ungu meskipun disertai dengan pengecatan oleh zat
warna kontras, warna ungu itu tetap dipertahankan. Bakteri yang memberikan reaksi semacam ini dinamakn bakteri Gram positif. Sebaliknya,
bakteri yang
tidak dapat menahan zat warna setelah didekolorisasi dengan alkohol akan kembali menjadi tidak berwarna dan bila diberikan pengecatan dengan zat warna
kontras,akan berwarna sesuai dengan zat warna kontras. Bakteri yang memperlihatkan reaksi semacam ini dinamakan bakteri Gram negatif Irianto,
2006. Kelompok mikroorganisme yang paling penting dan beraneka ragam, yang
berhubungan dengan makanan dan manusia adalah bakteri. Adanya bakteri dalam bahan pangan dapat mengakibatkan pembusukan yang tidak diinginkan atau
menimbulkan penyakit yang ditularkan melalui makanan. Bakteri adalah mikroorganisme bersel tunggal yang tidak terlihat oleh mata Buckle, 2007.
Berdasarkan perbedaan respons terhadap prosedur pewarnaan gram dan strktur dinding bakteri, bakteri diklasifikasikan menjadi bakteri gram negatif dan
bakteri gram positif.
2.7.1 Bakteri gram positif
Bakteri gram positif lebih sensitif terhadap penisilin, tetapi lebih tahan terhadap perlakuan fisik dibandingkan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif
sering berubah sifat pewarnaannya sehingga menunjukkan reaksi gram variabel. Sebagai contoh, kultur gram positif yang sudah tua dapat kehilangan
kemampuannya untuk menyerap pewarna violet kristal sehingga dapat berwarna merah seperti bakteri gram negatif. Perubahan tersebut dapat juga disebabkan oleh
perubahan kondisi lingkungan atau modifikasi teknik pewarnaan Fardiaz, 1992.
Universitas Sumatera Utara
Ciri-cirinya: Dinding sel mengandung peptidoglikan yang tebal serta diikuti pula
dengan adanya ikatan benang-benang teichoic dan teichoronic acid Pada umunya berbentuk bulat coccus
Pada perwarnaan gram, bakteri jenis ini berikatan dengan zat warna utama
yaitu gentian violet dan tidak luntur bila dicelupkan kedalam larutan alkohol
Dibawah mikroskop tampak berwarna ungu Nasution, 2014.
Contoh dari bakteri gram positif : Staphylococcus Aureus
Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat berdiameter 0,7-1,2 µm,tersu
sun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur seperti buah anggur,fakultatif anaerob,tidak membentuk spora,dan tidak bergerak.
Bakteri ini tumbuh pada suhu optimum 37 ̊C,tetapi membentuk pigmen paling baik pada suhu kamar 20-25 ̊C Jawetz et al, 1994.
Staphylococcusaureus adalah bakteri genus kokus Gram-positif utama penyebab penyakit. Bakteri ini bersifat positi-koagulase memulai pembentukan bekuan
fibrin, β-hemolitik, dan toleran garam halodurik. Staphylococcus aureus memiliki protein A pada permukaannya, yang mengikat Fc Ig menghambat
fagositosis, menghasilkan pigmen kuning dan mungkin memproduksi eksotoksinStaphylococcus aureus berdiam di mukosa hidung manusia atau di
kulit; kuman ini menyebar melalui tangan, bersin dan lesi kulit Hawley, 2003. Gambar bakteri Staphylococcus aureus pada gambar 2.8 dibawah ini.
Gambar 2.8 Bakteri Staphylococcus aureus Hawley, 2003.
Universitas Sumatera Utara
Penyakit yang disebabkan oleh bakteri Staphylococcus aureus terdiri atas empat jenis :Keracunan makanan Staphylococcus aureus dari enterotoksin stabil
terhadap panas yang terjadi akibat makanan yang kurang mendapat pendinginan dan tercemar oleh Staphylococcus aureus misal, ham, daging yang diasinkan atau
dikalengkan, kue custard, atau salad kentang. Ingesti toksin menyebabkan nyeri abdomen, muntah dan diare dengan onset cepat 1-6 jam dan Infeksi kulit atau
subkutis yang disebabkan oleh Staphylococcus aureus sering muncul sebagai nyeri dan panas, kemerahan dan pembengkakan subkutis. Pembedahan atau
neutropenia merupakan faktor predisposisi. Infeksi dapat menyebabkan penyakit kulit eksfoliativa scalded skin syndrome bila strainnya menghasilkan
eksofoliatin. Impetigo stafilokokus umumnya menimbulkan bula vesikel besar Hawley, 2003.
2.7.2 Bakteri gram negatif
Bakteri gram negatif lebih sensitif terhadap antibiotik lainnya seperti streptomisin dan bersifat lebih konstan terhadap reaksi pewarnaan Fardiaz, 1992. Dinding sel
bakteri gram negatif tersusun atas satu lapisan peptidoglikan dan membran luar. Dinding selnya tidak mengandung teichoic acid. Membran luar terususun atas
lipopolisakarida, lipoprotein dan pospolipid Tortora, 2001.
Ciri-cirinya: Mengandung sedikit sekali peptidoglikan dan tidak terdapat ikatan
benang-benang teichoic acid dan teichoronic acid
Pada umunya berbentuk batang basil kecuali basillus antharias dan
basillus sereus
Pada pewarnaan gram, bakteri jenis ini tidak mampu berikatan dengan zat warna utama yaitu gentian violet dan luntur bila dicelupkan kedalam
larutan alkohol Dibawah mikroskop tampak berwarna merah Nasution, 2014.
Universitas Sumatera Utara
Contoh bakteri gram negatif : Escherichia coli
Escherichia berbatang pendek.Habitat utamanya adalah usus manusia dan hewan. Escherichia coli dipakai sebagai organisme indikator, karena jika terdapat dalam
jumlah yang banyak menunjukkan bahwa pangan atau air telah mengalami pencemaran Gaman, 1992.
Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif dapat dilihat pada tabel 2.1 dibawah ini.
Tabel 2.1 Perbedaan bakteri gram positif dan gram negatif : Perbedaan
Bakteri gram Positif
Bakteri gram Negatif
Dinding sel : Lapisan peptidoglikan
Lebih tebal Lebih tipis
Kadar Lipid 1-4
11-12 Resistensi terhadap alkali KOH 1
Tidak larut Larut
Kepekaan terhadap Iodium Lebih peka
Kurang peka Toksin yang dibentuk
Eksotoksin Endotoksin
Resistensi terhadap tellurit Lebih tahan
Lebih peka Sifat tahan asam
Ada yang tahan asam
Ada yang
tidak tahan asam
Kepekaan terhadap penisilin Lebih peka
Kurang peka Kepekaan terhadap Streptomisin
Kurang peka Peka
Syahrurachaman, dkk., 1993.
Universitas Sumatera Utara
Dari tabel diatas didapatkan komponen penyusun dinding sel bakteri gram negatif dan positif yang ditunjukkan pada gambar 2.9 dibawah ini.
Gambar 2.9 Diagram perbandingan dinding sel bakteri gram positif dan gram negatif Talaro, K, P, 2008.
2.7.3 Pengukuran Aktivitas Antibakteri
Penentuan kerentanan patogen bakteri terhadap obat-obatan antimikroba dapat dilakukan dengan salah satu metode utama yaitu dilusi atau difusi. Metode-
metode tersebut dapat dilakukan untuk memperkirakan baik potensi antibiotik dalam sampel maupun kerentanan mikroorganisme dengan menggunakan
organisme uji standar yang tepat dan sampel obat tertentu untuk perbandingan. Metode-metode utama yang dapat digunakan adalah :
a.Metode Dilusi Sejumlah antimikroba dimasukkan kedalam medium bakteriologi padat atau cair.
Biasanya digunakan pengenceran dua kali lipat zat antimikroba. Medium akhirnya diinokulasikan dengan bakteri yang diuji dan diinokulasi. Tujuan akhirnya adalah
mengetahui seberapa banyak jumlah antimikroba yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri yang diuji. Uji kerentanan
dilusi agar membutuhkan waktu yang lama.
Universitas Sumatera Utara
b. Metode Difusi Metode yang paling sering digunakan adalah metode difusi agar dengan
menggunakan cakram kertas, cakram kaca, pencetak lubang. Prinsip metode ini adalah mengukur zona hambatan pertumbuhan bakteri yang terjadi akibat difusi
zat yang bersifat antibakteri di dalam media padat melalui pencadang. Daerah hambatan pertumbuhan bakteri adalah daerah jernih disekitar cakram. Luas daerah
hambatan berbanding lurus dengan aktivitas antibakteri, semakin kuat daya aktivitas antibakterinya maka semakin luas daerah hambatnya. Metode ini
dipengaruhi oleh banyak faktor fisik dan kimia, misalnya : pH, suhu, zat inhibitor, sifat dari media dan kemampuan difusi, ukuran molekul dan stabilitas dari bahan
obat Jawetz et al, 2001.
2.7.4 Mekanisme Kerja Antibakteri
Mekanisme antibakteri senyawa fenol dalam membunuh mikroorganisme yaitu dengan mendenaturasi protein sel. Ikatan hidrogen yang terbentuk antara fenol
dan protein mengakibatkan struktur protein menjadi rusak. Ikatan hidrogen tersebut yang mempengaruhi permebilitas dinding sel dan membran sitoplasma
sebab keduanya tersusun atas protein. Permebialitas dinding sel dan membran sitoplasma yang terganggu dapat menyebabkan ketidakseimbangan makromolekul
dan ion dalam sel, sehingga menjadi lisis Rijayanti, 2014. Mekanisme kerja antibakteri dapat dibagi menjadi 5 tahap yaitu sebagai berikut :
a. Inhibitor Sintesis Dinding Sel
Kerusakan dinding sel atau penghambatan pada pembentukannya dapat menyebabkan sel menjadi lisis. Dinding sel bakteri terdiri dari peptidoglikan yang
merupakan komples mukopeptida glikopeptida. Zat antibakteri menghambat sintesis peptidoglikan dinding sel bakteri dengan menghambat kerja enzim
tranpeptidase dan enzim rasemase alanin atau dengan menghambat sintesa asam muramat. Senyawa penisilin dan sefalosforin yang secara struktur mirip dan
senyawa-senyawa yang tidak mirip seperti siklorin, vankomisin, dan basitrain merupakan zat antibakteri yan bekerja menghambat sintesis dinding sel Setiabudi
dan Gan, 1995.
Universitas Sumatera Utara
b. Inhibitor Fungsi Membran sel
