Desain penelitian Lokasi dan waktu penelitian Pengolahan dan Analisa data

37

BAB IV METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Desain penelitian

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan rancangan post test only control group design yang bertujuan untuk mengetahui efek dari pengaplikasian ekstrak daun Iler Coleus scutellarioides Linn. Benth sebagai repellent terhadap Aedes aegypti. Objek penelitian dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol dan perlakuan yang dianggap sama sebelum pengujian dilakukan. Perbedaan hasil observasi yang didapat diantara kedua kelompok tersebut dianggap sebagai efek dari pemberian intervensi atau perlakuan treatment.

4.2 Lokasi dan waktu penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan September 2013 hingga Januari 2014 dan bertempat di Laboratorium Kimia, Ekologi, dan Pangan; Pusat Laboratorium Terpadu, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 4.3 Populasi, sampel, dan subjek uji penelitian 4.3.1 Populasi Populasi yang digunakan pada penelitian ini adalah Aedes aegypti steril yang didapat dengan memelihara nyamuk tersebut dari fase telur hingga dewasa. Telur 38 nyamuk didapatkan dari Laboratorium Entomologi dan Parasitologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB.

4.3.2 Sampel

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah Aedes aegypti betina steril dengan umur antara 2-5 hari, seperti yang diatur dalam Metode Standar Pengujian Efikasi, Komisi Pestisida Indonesia tahun 2012. Dalam panduan uji efikasi produk repellent pada kulit manusia yang dikeluarkan oleh USEPA 2010, disebutkkan bahwa setidaknya sebanyak 200 ekor nyamuk digunakan untuk setiap kurungan percobaan berukuran 2’x2’x2’ atau ± 232,000 cm 3 setara dengan ± 1 ekor nyamuk untuk setiap penambahan volume kurungan uji sebesar 1,160 cm 3 . Namun, menurut Fradin 2002 disarankan untuk menggunakan sampel dengan kepadatan yang rendah ± 10 ekor sebagai pertimbangan bahwa pada kondisi tersebut akan lebih akurat dalam menggambarkan frekuensi kontak antara manusia dan nyamuk yang dijumpai di lingkungan Fradin, 2002. Sehingga, jumlah sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 10 ekor Aedes aegypti yang ditempatkan pada kurungan uji berukuran ± 27 x 27 x 27 cm untuk setiap pengujian. Percobaan ini dilakukan replikasi sebanyak 4 kali seperti yang direkomendasikan dalam Metode Standar Pengujian Efikasi Pestisida Rumah Tangga dan Pengendalian Vektor yang dikeluarkan Direktorat Pupuk dan Pestisida 39 Kementerian Pertanian tahun 2012. Oleh sebab itu, jumlah sampel yang dibutuhkan adalah sebanyak ±160 ekor.

4.3.3 Subjek uji

Partisipasi sebanyak empat subjek uji atau volunteer diperlukan pada penelitian ini. Setiap subjek uji akan melakukan serangkaian uji efikasi yang terdiri dari konsentrasi kontrol 0 dan konsentrasi ekstrak uji 20, 40, 60, dan 100 vv, dimana untuk uji coba peningkatan konsentrasi ekstrak uji dilakukan pada hari berikutnya WHOPES, 20009; Komisi Pestisida Indonesia, 2012. Uji efikasi dilakukan replikasi atau pengulangan sebanyak 4 kali, dimana untuk setiap replikasi melibatkan subjek uji yang berbeda. Hal tersebut bertujuan untuk menghilangkan pengaruh dari perbedaan jenis kulit terhadap hasil uji repelansi daya proteksi yang didapat Rajkumar, 2010. Berikut skema rangkaian uji efikasi yang dilakukan. Hari ke-1 Hari ke-2 Hari ke-3 Hari ke-4 Subjek uji 1 Subjek uji 3 Subjek uji 2 Subjek uji 4 R 1 K + 100 K + 60 K + 40 K + 20 R 2 K + 40 K + 60 K + 100 K + 20 R 4 K + 100 K + 60 K + 20 K + 40 R 3 K + 60 K + 40 K + 100 K + 20 40 Semua subjek uji yang berpartisipasi dalam penelitian ini telah menandatangani surat persetujuan atau informed consent setelah sebelumnya diberikan penjelasan terkait tujuan penelitian, prosedur, dan risiko yang mungkin timbul pada subjek uji saat penelitian berlangsung. Protokol uji efikasi repellent ekstrak daun Iler yang dilakukan pada penelitian ini telah disetujui oleh Komite Etik FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Minimalisasi risiko terhadap kesehatan dan keselamatan subjek uji yang mungkin timbul akibat penelitian ini perlu dilakukan, karena terdapat golongan individu tertentu yang sangat rentan terhadap kontak dengan nyamuk. Kelompok tersebut diantaranya lansia, bumil dan menyusui, dan perokok WHOPES, 2009; USEPA, 2010. Selain itu, perlu diperhatikan juga minimalisasi faktor pengganggu yang dapat mempengaruhi kinerja optimum ekstrak daun Iler sebagai repellent, seperti penggunaan parfum atau produk repellent sebelum pengujian. Bau dari produk tersebut dapat meningkatkan atau menihilkan bau dari ekstrak uji yang diterima oleh protein OBPs pada olfaktori nyamuk WHOPES, 2009; Qiu dan van Loon, 2010. Oleh karena itu, untuk mengantisipasi kedua permasalahan tersebut, maka perlu ditetapkan kriteria dalam pemilihan subjek uji, yaitu sebagai berikut: Gambar 4.1 Rangkaian Uji Efikasi Keterangan: K = Kontrol konsentrasi 0 R = Replikasi atau pengulangan 41 1. Pria atau wanita sehat umur 18-55 tahun; kecuali bumil dan menyusui, dan perokok dapat dilibatkan jika tidak mengkonsumsi rokok selama 12 jam sebelum pengujian berlangsung. 2. Tidak memiliki riwayat alergi atau sensitif terhadap kontak dengan nyamuk dan senyawa kimia tertentu. 3. Menghindari pemakaian produk repellent dan parfum selama 12 jam sebelum pengujian dilakukan, dan saat pengujian berlangsung. Mengacu pada kriteria diatas, maka didapatkan proporsi perbandingan jumlah wanita dan pria sehat yang terlibat sebagai subjek uji yaitu sebesar 3:1, dengan usia berada pada rentang 20 - 22 tahun. 4.4 Alat dan Bahan 4.4.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah vacuum rotary evaporator, blender, oven, gelas ukur, kurungan pemeliharaan, shaker, labu erlenmeyer, neraca analitik, counter, botol sprayer tangan, tabung reaksi bertutup, destilator, penangas pasir, desikator, kurungan uji terbuat dari kawat kasa dengan lapisan kaca dikedua sisi untuk mempermudah pengamatan berukuran ± 27 cm x 27 cm x 27 cm dengan diameter lubang ±14 cm, sarung tangan lateks, kertas saring, corong, alumunium foil, termohigrometer, Stop watch, mikro pipet, aspirator, kain kasa dan kapas. 42

4.4.2 Bahan

Bahan yang digunakan adalah daun Iler, telur Aedes aegypti, ethanol 70, aquades, air mineral, larutan gula 10 dan pelet fish food. 4.5 Prosedur kerja 4.5.1 Pemeliharaan rearing Aedes aegypti Nyamuk yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dengan membiakkan telur Aedes aegypti steril yang diperoleh dari Laboratorium Entomologi dan Parasitologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Ketika telur menetas menjadi larva, larva tersebut akan diberi pakan ikan hingga mencapai stadium pupa fase dorman. Setelah mencapai stadium dewasa, nyamuk akan diberi pakan berupa larutan gula 10 hingga mencapai target umur yang akan digunakan dalam percobaan. Dalam pengembangbiakan nyamuk, perlu diperhatikan kondisi fisik lingkungan sekitar dengan mengikuti standar yang ditetapkan oleh WHOPES 2009 yang mencakup aspek temperatur 27 ± 2 o C; dan kelembaban ≥ 80 ± 10 untuk memastikan siklus gonotropik nyamuk tetap berlangsung. Penggunaan nyamuk steril uninfected pada penelitian ini bertujuan untuk memberikan jaminan kesehatan dan keselamatan subjek penelitian dari adanya transmisi patogen. Penggunaan nyamuk steril pada uji efikasi diketahui juga dapat mendorong respon imun subjek uji untuk membentuk suatu proteksi terhadap patogen. Penelitian yang dilakukan Donovan et al 2007 pada mencit yang terpapar gigitan A. stephensi steril berulang-ulang, didapatkan adanya dorongan pada respon 43 imun untuk membentuk T-helper 1 Th1 phenotype yang diketahui efektif bekerja dalam menekan penyebaran infeksi malaria. 4.5.2 Pembuatan Ekstrak Daun Iler 4.5.2.1 Proses Pemilihan dan Pengeringan Coleus blumei atau Iler yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari pot-pot pekarangan rumah penduduk pada kawasan padat pemukiman di daerah Jakarta dan Bogor. Daun Iler dipilih yang kondisinya baik tidak muda dan tidak tua, dan kemudian dibersihkan dari kotoran yang menempel. Setelah disortir dan dicuci bersih, daun Coleus blumei tersebut kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 50 selama ± 2 hari. Bahan kering tersebut kemudian dihancurkan dengan blender sampai menjadi serbuk.

4.5.2.2 Proses Pembuatan Ekstrak Tanaman Uji

Serbuk halus daun Iler yang telah diketahui bobotnya dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer untuk direndam dalam pelarut yang digunakan, yaitu etanol 70 dengan perbandingan 1:10. Kemudian sampel diaduk menggunakan shaker selama 24 jam. Sampel tersebut disaring untuk memisahkan filtrat dengan ampas. Selanjutnya ampas dicampur kembali dengan pelarut dengan perbandingan 1:5. Larutan tersebut kembali disaring dan ditampung untuk dicampur dengan hasil saringan utama. Masing-masing filtrat kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada suhu ±60°C yang dilanjutkan dengan menggunakan penangas pasir untuk 44 menguapkan pelarut. Proses pemekatan dihentikan setelah semua senyawa ethanol menguap dan didapat ekstrak kasar induk daun Coleus blumei atau Iler. Dari ekstrak kasar induk tadi kemudian dibuat berbagai konsentrasi uji yang akan digunakan menggunakan larutan etanol 70 dengan perbandingan volume per volume mlml dengan menggunakan rumus pengenceran: C 1 x V 1 = C 2 x V 2 Keterangan: C 1 : Konsentrasi ekstrak kasar induk 100 C 2 : Konsentrasi ekstrak uji yang diinginkan V 1 : Volume ekstrak kasar induk yang harus dilarutkan V 2 : Volume ekstrak uji yang dinginkan 4.5.3 Pengujian 4.5.3.1 Uji Efikasi Setelah didapatkannya ekstrak kasar induk daun Iler atau Coleus blumei, selanjutnya dilakukan uji pendahuluan dengan satu kali replikasi menggunakan konsentrasi ekstrak daun Iler sebesar 5 vv, 10 vv, 20 vv, dan 40 vv. Hal tersebut bertujuan untuk menentukan rangkaian konsentrasi ekstrak daun Iler yang menimbulkan efek repellent kurang dari 50 2-3 konsentrasi dan lebih dari 50 2-3 konsentrasi untuk digunakan dalam penelitian ini, seperti yang direkomendasikan oleh WHOPES 2009 untuk uji repellent pada skala laboratorium. 45 Pengujian efikasi dilakukan dengan metode uji repelansi atau daya proteksi berdasarkan Metode Standar Pengujian Efikasi Pestisida Rumah Tangga dan Pengendalian Vektor yang dikeluarkan oleh Direktorat Pupuk dan Pestisida Kementerian Pertanian tahun 2012. Untuk melakukan uji efikasi, langkah pertama yang dapat dilakukan yaitu penyiapan ekstrak daun Iler pada konsentrasi 20, 40, 60, dan 100 vv yang telah ditetapkan sebagai konsentrasi uji berdasarkan hasil uji pendahuluan yang didapat dengan mengacu pada estimasi WHOPES 2009. Kemudian dilanjutkan dengan penyiapan kurungan uji berukuran ± 27 x 27 x 27 cm 2 yang diisi sebanyak 10 ekor Aedes aegypti betina steril yang telah diberikan pakan larutan gula 10 dan dibuat lapar selama 12 jam sebelum proses pengujian dilakukan. Langkah selanjutnya yaitu menutupi daerah pergelangan tangan hingga ujung jari lengan kontrol dan lengan perlakuan menggunakan sarung tangan lateks. Lengan terlebih dulu dicuci dengan air atau aquades hingga bersih, lalu dikeringkan WHOPES, 2009. Kemudian lengan perlakuan lengan kiri diaplikasi ekstrak uji dengan dosis 0,5 mgcm 2 0,375 ke permukaan lengan secara merata, dan dibiarkan selama 5 menit. Bagian lengan yang dipaparkan sebatas persendian tangan hingga siku, dengan perhitungan area paparan WHOPES, 2009: ….cm 2 Keterangan: cw → lingkar pergelangan tangan cm 46 ce → lingkar siku fosa kubiti bagian bisep cm Dwe → jarak antara cw dan ce cm Selama masa tunggu pengaplikasian ekstrak uji, subjek tidak diperbolehkan melakukan kegiatan apapun untuk minimalisasi kecepatan penguapan senyawa volatil yang terkandung dalam ekstrak daun Iler. Lengan kontrol lengan kanan dimasukkan kedalam kurungan uji selama 5 menit. Secara bergantian, masukkan lengan perlakuan ke dalam kurungan uji selama 5 menit. Setiap pengujian menggunakan nyamuk Aedes aegypti yang belum pernah dipakai sebelumnya. Nyamuk yang tidak aktif atau mati selanjutnya diambil dan diganti dengan nyamuk baru menggunakan aspirator. Pengujian akan dihentikan ketika telah mencapai efficacy failure, yaitu terjadinya probing penetrasi tanpa terjadi penghisapan darah Aedes aegypti sebanyak 2 kali pada lengan subjek uji USEPA, 2010. Jumlah nyamuk yang hinggap pada kedua lengan tersebut dihitung dari jam ke-0 segera setelah pemaparan sampai terjadinya efficacy failure. Prosedur yang sama juga berlaku untuk pengujian di interval waktu berikutnya hingga interval jam ke-6, seperti yang tertera dalam Metode Standar Efikasi oleh Komisi Pestisida 2012 dan repellent test guideline oleh USEPA 2010. Nilai efikasi ditentukan berdasarkan daya proteksi yang dihitung dengan rumus: Daya Proteksi DP x 100 47 Keterangan: Ca = Frekuensi nyamuk hinggap pada lengan kontrol Ta = Frekuensi nyamuk hinggap pada lengan perlakuan 4.6 Pengumpulan data 4.6.1 Data primer Data primer pada penelitian ini diperoleh langsung dari hasil uji efikasi laboratorium, yaitu berupa data jumlah nyamuk yang hinggap pada lengan subjek uji yang diamati mulai dari periode pengujian jam ke-0 hingga jam ke-6. Data tersebut selanjutnya dicatat dan diolah untuk mengetahui data persentase daya proteksi.

4.6.2 Data sekunder

Data sekunder yang diperoleh pada penelitian ini bersumber dari studi kepustakaan berupa buku atau jurnal-jurnal yang memuat tentang penelitian serupa, teori-teori pendukung, data-data statistik, dan berupa guideline pelaksanaan uji efikasi repellent dengan menggunakan manusia sebagai subjek uji.

4.7 Pengolahan dan Analisa data

Pengolahan dan analisa data dilakukan dengan menggunakan program statistik computer SPSS for windows. Data pengamatan berupa jumlah nyamuk yang hinggap pada lengan subjek uji kontrol dan perlakuan kemudian digunakan untuk menentukan nilai daya proteksi untuk masing-masing konsentrasi ekstrak daun Iler 48 selama tujuh interval waktu pengujian jam ke-0 hingga ke-6. Data daya proteksi yang didapat selanjutnya dianalisa menggunakan uji Anova untuk mengetahui adanya perbedaan daya proteksi diantara variasi konsentrasi ekstrak daun Iler 20, 40, 60, dan 100. Data daya proteksi tersebut selanjutnya dianalisa dengan metode probit dan dilanjutkan dengan uji regresi linier untuk mendapatkan persamaan garis yang digunakan untuk menentukan nilai EC 50 konsentrasi ekstrak yang memberikan efek repellent atau daya proteksi sebesar 50 ekstrak daun Iler selama tujuh interval waktu pengujian. Kemudian dilanjutkan dengan uji korelasi pearson dan regresi linier untuk mengetahui adanya hubungan serta berapa besar hubungan antara variasi konsentrasi dan lamanya interval waktu terhadap daya proteksi atau potensi ekstrak daun Iler sebagai plant-based repellent terhadap Aedes aegypti yang didapat. 49

BAB V HASIL

5.1 Pengaruh Ekstrak Daun Iler Coleus scutellarioides Linn. Benth Sebagai Plant-based Repellent Terhadap Aedes aegypti Daya tolak repellent ekstrak daun Iler Coleus scutellarioides Linn. Benth terlihat dari frekuensi hinggap Aedes aegypti pada lengan subjek uji yang telah diaplikasi variasi konsentrasi ekstrak daun Iler 0, 20, 40, 60, dan 100 hingga terjadinya efficacy failure untuk setiap interval waktu pengujian jam ke-0 hingga ke-6. Sebelum prosedur tersebut diterapkan, terlebih dulu dilakukan standardisasi pada sampel dan subjek uji, yang bertujuan untuk mencegah terjadinya bias pada penelitian karena munculnya keanekaragaman data. Standardisasi Aedes aegypti dilakukan dengan homogenisasi morfologi berupa umur 2-5 hari; bionomik feeding activity, yaitu dengan memblok akses larutan gula 12 jam sebelum pengujian; serta dilakukan pengukuran suhu dan kelembaban ruangan uji untuk memastikan siklus gonotropik tetap berlangsung. Pada subjek uji, homogenisasi dilakukan pada respon fisiologis, yaitu dengan menetapkan kriteria seperti tidak memiliki riwayat alergi dan tidak memakai produk repellent atau parfum; serta perilaku, yaitu dengan membatasi pergerakan subjek uji saat uji efikasi berlangsung.