24
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
air yang ada pada gel separating dibuang. Larutan gel stacking dituang sampai batas atas kaca, comb dimasukkan, kemudian
ditunggu ± 20 menit sampai gel memadat. Setelah gel memadat, gel dipindahkan dari casting frame
dengan cara menekan cams pada casting frame. Gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short
plate menghadap ke dalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, kemudian ditutup kedua camp levers pada clamping frame.
Lower inner chamber dimasukkan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan working solution buffer elektroforesis SDS 1x pH 8.3.
Masing-masing sampel IV, W1, W2, E1, E2 diambil 4 µl lalu dimasukkan ke dalam eppendorf tube 1,5 ml dan ditambahkan
Loading dye Lampiran 6c kemudian didenaturasi pada suhu 95
o
C selama 10 menit. Marker precision plus protein standard sebanyak 4
µl dimasukkan ke dalam well. Sampel yang telah didenaturasi dimasukkan masing-masing sebanyak 5 µlwell. Kemudian gel
dirunning pada 40 mA selama 90 menit. Gel diangkat lalu direndam dalam commasie Blue G
–250 staining solution Lampiran 6d selama 1 jam sambil digoyang-goyang diatas rocker. Gel dibilas
dengan commasie blue G –250 destaining solution Lampiran 6e
± 20 menit, dengan dua kali pengulangan. Gel dibilas dengan H
2
O sampai bau asamnya hilang dan disimpan pada suhu 4
o
C.
3.3.8.4. Uji aktivitas ATPase RNA Helikase HCV
Pengujian aktivitas ATPase RNA helikase HCV ini menggunakan enzim RNA helikase yang telah dipurifikasi. Enzim RNA
helikase dibuat dengan berbagai pengenceran 5x, 10x, 20x, 40, 80x. Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquabides dan 45 µl master mix
H
2
O, MOPS, MgCl, dan ATP. Untuk sampel uji, konsentrasi akhir reaksi sebesar 50 µlwell mengandung 45 µl master mix H
2
O, MOPS, MgCl, ATP, dan RNA helikase HCV dan 5 µl enzim. Campuran reaksi
diinkubasi dalam microtiter plate 96-well, pada suhu ruang selama 45
25
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
menit. Hasil reaksi divisualisasikan dengan penambahan 100 µlwell larutan pewarna malachite green. Reaksi diinkubasi selama 5 menit,
kemudian ditambahkan sodium sitrat untuk menghentikan reaksi warna. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 620 nm dengan referensi
405 nm Utama et al,2000.
3.3.8.5. Uji Aktivitas Jintan Hitam Nigella sativa L. sebagai Inhibitor RNA
Helikase HCV
Pengujian inhibisi enzim helikase hepatitis C ini menggunakan sampel berupa ekstrak kental biji jintan hitam dari 3 jenis pelarut n-
heksan, etil asetat dan metanol. Pengujian ini dilakukan dengan menggunakan uji ATPase kolorimetri Utama et al, 2000, yaitu dengan
mengukur jumlah fosfat yang dilepaskan dari hidrolisis senyawa ATP menjadi ADP dan Pi.
Masing-masing ekstrak kental jintan hitam dibuat dengan berbagai konsentrasi yakni 500 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm, 4000 ppm,
8000 ppm, 16000 ppm dan 32000 ppm. Ekstrak kental jintan hitam ini dilarutkan dengan menggunakan metanol p.a.
Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquabides dan 45 µl master mix H
2
O, MOPS, MgCl, ATP dan RNA helikase dan untuk sampel konsentrasi akhir reaksi sebesar 50 µlwell menggandung 45 µl
master mix H
2
O, MOPS, MgCl, ATP, dan RNA helikase HCV dan 5 µl ekstrak. Campuran reaksi diinkubasi dalam microtiter plate 96-well, pada
suhu ruang selama 45 menit. Hasil reaksi divisualisasikan dengan penambahan 100 µlwell larutan pewarna malachite green. Reaksi
diinkubasi selama 5 menit, kemudian ditambahkan sodium sitrat untuk menghentikan reaksi warna. Absorbansi diukur pada panjang gelombang
620 nm dengan referensi 405 nm Utama et al, 2000. Persentase inhibisi dapat dihitung dengan rumus :
Keterangan : A = Absorbansi enzim RNA helikase tanpa penambahan sampel
I = Absorbansi enzim RNA helikase dengan penambahan sampel Inhibisi
= A – I x 100
A
26
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Determinasi Biji Jintan Hitam
Determinasi dilakukan untuk mengidentifikasi sampel yang dipakai dalam penelitian ini. Determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang
Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong, Bogor. Berdasarkan surat keterangan yang diperoleh, dinyatakan bahwa sampel yang didapatkan dari
Pasar Impres Senen Blok B6 Jakarta Pusat termasuk jenis Nigella sativa L. dari suku Ranuculaceae. Keterangan hasil determinasi sampel tersebut dapat
dilihat pada Lampiran 1.
4.2. Rendemen Ekstrak
Ekstraksi biji jintan hitam dilakukan dengan metode maserasi. Metode maserasi ini dipilih karena metode ini sesuai untuk senyawa
–senyawa yang tidak tahan panas. Menurut Yuliani 2010 proses maserasi adalah
proses perendaman sampel dalam pelarut organik pada temperatur kamar. Prinsip ekstraksi ini ditekankan pada interaksi yang cukup antara pelarut
dengan jaringan sampel yang akan diekstraksi. Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi bahan alam karena selama proses perendaman
akan terjadi proses pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar selnya sehingga metabolit sekunder yang
ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik Leny, 2006. Kelebihan ekstraksi maserasi adalah metode yang dilakukan cenderung
murah dan alat-alat yang digunakan tergolong sederhana. Proses ekstraksi didasarkan pada kelarutan komponen terhadap
komponen yang lain dalam campuran. Kelarutan suatu komponen tergantung pada derajat kepolarannya. Hukum “like dissolved like” menyatakan bahwa
senyawa yang bersifat polar hanya dapat larut dalam pelarut polar dan semipolar, begitupun sebaliknya senyawa yang bersifat nonpolar hanya dapat
larut dalam pelarut nonpolar dan semipolar Yuliani, 2010.
